一测多评法同时测定蟾皮中7种蟾毒内酯

祝坤赟， 周成美， 任 鑫， 李芳洁， 胡晶红,2*， 张永清,2*， 刘 谦,2

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省质量控制与中药全产业链建设协同创新中心，山东 济南 250355)

蟾皮别名蟾皮、蛤蟆皮，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanosticusSchneider的干燥全皮[1]，最早记载于《本经逢原》，临床上被广泛用于治疗恶性肿瘤、毒疮、肠头挺出等疾病，具有抗肿瘤[2]、抗炎[3]、免疫调节、抗菌与抗病毒、强心等药理作用[4-5]，以华蟾素为代表的相关中药制剂在临床抗肿瘤治疗中有着突出疗效，正引起国内外学者广泛关注。但2020年版《中国药典》未收录蟾皮，地方中药材质量标准也只有广西壮族自治区、江苏省、辽宁省、河南省、陕西省收录，而且定性部分较多，定量部分缺少或模糊，整体质量控制水平不高。目前，学者普遍认为华蟾素制剂主要抗肿瘤成分为蟾皮中的蟾毒内酯[6-7]，故该类成分含量测定对评价蟾皮及其提取物中药制剂质量至关重要。

一测多评法利用中药材有效成分的比例和函数关系，通过单一内标来建立对多组分的同步定量的品质评价模型，近年来在中药材多指标成分含量测定中广泛应用[8-9]，但目前蟾皮中蟾毒内酯的的相关研究鲜有报道。因此，本实验通过一测多评法同时测定蟾皮中华蟾酥毒基、日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、远华蟾蜍精、伪异沙蟾毒精的含量，以期为控制该药材质量及相关资源开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Waters Xbridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME-204电子天平[万分之一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Sorvall ST 8R离心机(热电实验设备有限公司 奥斯特罗德分公司)。

1.2 试剂与药物 华蟾酥毒基(批号W27M10Z84297，纯度≥98%)、酯蟾毒配基(批号C30S8G45143，纯度≥98%)、日蟾毒它灵(批号P17O9F72594，纯度≥98%)、远华蟾蜍精(批号Y13A9Y67875，纯度≥98%)、蟾毒灵(批号P27F10F81703，纯度≥98%)、蟾毒它灵(批号P28M10F84299，纯度≥98%)、伪异沙蟾毒精(批号Y18O9Y72597，纯度≥98%)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

1.3 药材 蟾皮购自山东日照，经山东中医药大学张永清教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor的干燥全皮，置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，剪成约4 mm的方形小块，放入贴好标签的离心管中备用。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脱(0～5 min，20%～28%A；15～30 min，28%～29%A；30～35 min，29%～36.5%A；35～45 min，36.5%～38%A；45～46 min，38%～100%A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长296 nm；进样量20 μL。HPLC色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备 精密称取伪异沙蟾毒精、日蟾毒它灵、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品适量，甲醇制成质量浓度均为0.05 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 精密称取置于离心管中的烘干蟾皮1.0 g，放到烧瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流提取60 min，水浴加热浓缩，甲醇定容至5 mL量瓶中，即得。

2.4 线性关系考察 精密移取对照品溶液，稀释后在“2.1”项色谱条件下进样测定，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各蟾毒内酯线性关系

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得伪异沙蟾毒精、日蟾毒它灵、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基峰面积RSD分别为0.99%、1.97%、2.41%、1.33%、1.00%、0.88%、1.31%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、10、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得伪异沙蟾毒精、日蟾毒它灵、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基峰面积RSD为1.96%、1.00%、0.64%、1.00%、1.17%、2.29%、1.16%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批次蟾皮，平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。测得伪异沙蟾毒精、日蟾毒它灵、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基含量RSD分别为1.83%、1.73%、2.05%、1.00%、1.52%、2.40%、1.45%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取同一批次蟾皮6份，每份约0.5 g，加入100%水平对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得伪异沙蟾毒精、日蟾毒它灵、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基平均加样回收率分别为99.63%、97.76%、99.12%、100.83%、98.67%、99.39%、97.61%，RSD分别为1.95%、1.58%、1.15%、1.78%、1.92%、2.14%、2.69%。

2.9 相对校正因子计算 精密吸取“2.2”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样1、2 、5、8 、10、20 μL测定，平行2次，以华蟾酥毒基为内标，计算其他6种蟾毒内酯的相对校正因子fk/s，公式为fk/s=fk/fs=(WkAs)/(WsAk)(Wk为其他成分质量浓度，Ak为其他成分峰面积，Ws为内标质量浓度，As为内标峰面积)[7]，结果见表2。

2.10 各因素对相对校正因子的影响 测定不同体积流量(0.8、0.9、1.0 mL/min)、柱温(30、35、40 ℃)、仪器(Agilent 1260、Waters e2695)、色谱柱(Agilent 1260、Waters e2695、Agilent ZORBAXSB-C18、Waters Xbridge C18、Diamonsil C18)对各蟾毒内酯相对校正因子的影响，结果见表3～5，可知均无明显影响(RSD<3%)。

2.11 色谱峰定位 各蟾毒内酯在不同色谱仪、色谱柱上相对保留时间的差异较小，RSD均小于2.28%，见表6。

表3 不同体积流量对相对校正因子的影响

表4 不同柱温对相对校正因子的影响

表5 不同仪器与色谱柱对相对校正因子的影响

表6 相对校正因子保留时间

2.12 样品含量测定 取6批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含量，再采用t检验进行统计学分析，结果见表7，可知2种方法所得结果接近。

3 讨论

3.1 色谱柱选择 蟾皮中蟾毒内酯含量较低，为了提高检测准确度，需要较大的进样体积。本实验发现，在Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)(短柱)下各蟾毒内酯色谱峰出现前延，可能是其载样量较小所致，而在Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)(长柱)下未出现上述现象，峰形良好，故选择其开展后续研究。

3.2 流动相选择 本实验以乙腈[10]为有机相，对甲酸[11]、乙酸[12]、磷酸二氢钾[13-14]、磷酸[15]、纯水[16]等无机相进行了考察。结果，以乙腈-0.1%甲酸洗脱时各蟾毒内酯色谱峰峰形良好，均在40 min前即出峰，效率高，分离度理想。

3.3 供试品溶液制备方法选择 本实验以各蟾毒内酯提取率为考察指标，固定甲醇为提取溶液，考察了不同提取方法(加热回流、超声[17-18])、料液比(1∶20、1∶50、1∶100)、提取时间(30、60、90 min[19-20])。最终，选择料液比1∶50，加热回流提取60 min后浓缩作为供试品溶液制备方法。

表7 各蟾毒内酯含量测定结果(mg/g，n=2)

4 结论

本实验首次采用一测多评法同时测定蟾皮中华蟾酥毒基、日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、酯蟾毒配基、远华蟾蜍精、伪异沙蟾毒精7种蟾毒内酯的含量，通过精密度、重复性、稳定性试验，以及相对校正因子在不同柱温、体积流量、仪器、色谱柱下的耐用性，验证了该方法的准确性和可行性，可为确保该药材质量稳定提供依据。