不同提取和测定方法对蟾酥蛋白提取率和含量的影响

王 鹏， 张 雯， 周 迪， 张刘强， 吴迎春， 郭夫江*， 李医明*

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肿瘤一科，上海 200437)

蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider的干燥分泌物[1]，作为一味重要的传统中药，其化学成分复杂，临床用途较广，具有解毒、止痛、开窍醒神功效，在麝香保心丸、六神丸等中起着重要的作用。随着对蟾酥研究的逐步深入，其小分子化学成分及药理活性机制日益清晰，主要用于抗肿瘤、强心、抗菌、镇痛等方面[2-5]，甚至局部麻醉，而且疗效显著。

生物大分子药物由于具有高活性、强特异性、低毒性和生物功能明确等特点而受到重视，但对动物类中药中蛋白类大分子成分的研究较少。近年来，人们对天然来源大分子，例如核酸、蛋白质的替代药物越来越感兴趣[6]，它们与中药中的小分子次级代谢产物共同发挥有效作用。研究天然产物中蛋白质的结构和功能时，首先要得到高纯度的蛋白，故高效的提取分离方法是基础。

以往对蟾酥的研究集中在蟾酥甾烯等小分子成分上[7]，而对其大分子成分关注较少。本实验分别采用碱提醇沉法、Tris-NaCl溶液法、PBS溶液法、丙酮沉淀法提取蟾酥鲜浆中蛋白，并通过优化提取溶液的pH值来改善提取效果，提高蛋白提取率。另外，蛋白质含量的准确测定也至关重要，通常有凯氏定氮法[8]、福林酚法(Lowry法)[9]、双缩脲法[10]、考马斯亮蓝法(Bradford法)[11]、2，2′-联喹啉-4，4’-二羧酸法(BCA法)[12]、紫外-可见分光光度法[13]等，本实验分别采用Bradford法、BCA法测定蟾酥蛋白含量，旨在为该类成分含量测定提供参考。

1 材料

1.1 药材与试剂 蟾酥鲜浆(用于蛋白提取和含量研究，上海金蟾健康科技有限公司，批号20170419；用于不同来源药材蛋白含量比较，产地汉中、山东、浙西、江西、安皖、临沂小、临沂大、皖北、上海、河南)。BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Bradford蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Scientific公司)。NaOH、Tris、氯化钠、乙醇、丙酮、PBS溶液均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器 5810R离心机(德国Eppendorf公司)；Ultracel®-3K超滤管(德国Merck Millipore公司)；Paradigm®酶标仪(美国Molecular Devices公司)；96孔板(美国Corning公司)。

2 方法与结果

2.1 蟾酥蛋白提取

2.1.1 碱提醇沉法 取-80 ℃冷冻蟾酥鲜浆5 g，各3份，分别置于3个烧杯中，室温解冻1 h。为考察提取液碱性强弱对蛋白提取率的影响，在加入100 mL去离子水后用1 mol/L NaOH溶液分别调节3份提取液pH至7.8、9.0、10.2，加去离子水至最终体积为200 mL，烧杯中加入搅拌子，室温提取5 h，静置，将上清液转移至若干个50 mL离心管中，3 900 r/min离心1 h，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，合并滤液，加入200 mL冰乙醇[14](-20 ℃放置2 h)，离心收集沉淀，200 mL溶液(含25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH7.8)复溶。

2.1.2 Tris-NaCl溶液法 取-80 ℃冷冻蟾酥鲜浆5 g，各3份，分别置于3个烧杯中，室温解冻1 h。为考察Tris-NaCl提取液酸碱性对蛋白提取率的影响，分别于3个烧杯中加入Tris-NaCl(含25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl，pH5.4)溶液、Tris-NaCl(含25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl，pH7.8)[15]溶液、Tris-NaCl(含25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl，pH10.2)溶液至最终体积为200 mL。烧杯中加入搅拌子，室温提取5 h，静置，将上清液转移至若干50 mL离心管中，3 900 r/min离心1 h，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，合并滤液。

2.1.3 PBS溶液法 取-80 ℃冷冻蟾酥鲜浆5 g，置于烧杯中，室温解冻1 h。由于100 mmol/L PBS(pH7.0)溶液前期被优选用于蛋白提取[16]，故在烧杯中加入该溶液至最终体积为200 mL，烧杯中加入搅拌子，室温提取5 h，静置，将上清液转移至若干个50 mL离心管中，3 900 r/min离心1 h，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，合并滤液。

2.1.4 丙酮沉淀法 取-80 ℃冷冻蟾酥鲜浆5 g，置于烧杯中，室温解冻1 h，加入磷酸缓冲溶液(20 mmol/L，pH8.0)至最终体积为200 mL，烧杯中加入搅拌子，室温提取5 h，静置，上清液转移至若干个50 mL离心管中，3 900 r/min离心1 h，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，合并滤液，加入200 mL冰丙酮[17-18](-30 ℃放置2 h)，离心收集沉淀，200 mL溶液(含25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH7.8)复溶。

2.2 超滤去除小分子 在4 ℃、3 900 r/min条件下用超滤管[19]离心浓缩蟾酥提取物溶液，使蛋白与小分子分离，将滤液弃去，合并浓缩液，用相应条件下提取液溶解浓缩物后继续超滤，重复5次，最后将浓缩物用相应的提取液或复溶溶液溶解并定容至100 mL，在-80 ℃下保存。

2.3 蛋白含量测定

表1 标准曲线加样(BCA法)

表2 蟾酥蛋白含量测定结果(BCA法)

2.3.2 Bradford法 BSA蛋白标准液(2.0 mg/mL)用0.9% NaCl溶液稀释至1 000 μg/mL，按表3方法进行稀释，配制BSA标准品(0号管为空白对照)。将10 μL标准品及不同提取方法得到的样品稀释50倍，置于96微孔板孔中，每孔加入250 μL考马斯亮蓝试剂，微孔板振荡器混合30 s，取出微孔板，室温孵育10 min，酶标仪测定595 nm波长处吸光度。以标准品质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=0.001 2X+0.350 8(r=0.997 5)，计算蛋白含量，结果见表4。

表3 标准曲线加样(Bradford法)

表4 蟾酥蛋白含量测定结果(Bradford法)

再比较碱提醇沉法、Tris-NaCl溶液法、PBS溶液法、丙酮沉淀法对蟾酥蛋白提取率的影响，结果见图1。由此可知，碱提醇沉法提取率较低，pH值对其影响不大；Tris-NaCl溶液法提取率较高，在pH为7.8时更明显；PBS溶液法、碱提醇沉法提取率相差不大，丙酮沉淀法提取率最低；采用BCA法、Bradford法测定蟾酥蛋白含量时，所得结果大致相同。

2.3.3 对比试验 分别采用BCA法、Bradford法测定Tris-NaCl溶液法(pH7.8)所提取蟾酥蛋白含量各6次，结果见表5。由此可知，2种方法重复性均良好；F=1.86，F

表5 BCA法、Bradford法测定蟾酥蛋白含量比较(n=6)

2.3.4 不同来源蟾酥鲜浆中蛋白含量 采用Tris-NaCl溶液法(pH7.8)提取10个产地蟾酥鲜浆蛋白，测定其提取率，结果见表6。由此可知，提取率均在20%左右，表明该提取方法稳定可靠。

表6 不同产地蟾酥鲜浆蛋白提取率测定结果

3 讨论

本实验发现，不同提取方法下蟾酥中蛋白提取率有差异，其中丙酮沉淀法最低，Tris-NaCl溶液法(pH7.8)最高，提取率为24.7%，并且该方法操作简单，对活性蛋白质破坏作用极小，适用于不同产地的样品基质，并且提取后的蛋白溶液可以根据临床应用、生产的特殊要求进行缓冲液置换，满足临床应用和生产的需求。常用蛋白含量的测定方法都存在一定局限性，例如凯氏定氮法灵敏度较低，操作繁琐，实验周期较长；Lowry法因干扰物质较多，所得结果通常不准确；双缩脲法、紫外分光光度法虽然简便快速，但前者灵敏度低，后者仅适用于纯化蛋白质的检测。本实验分别采用BCA法、Bradford法测定蟾酥蛋白含量，两者灵敏度高，操作快速简便，并且前者所用试剂及其形成的颜色复合物稳定性良好，干扰物质较少，而后者还具有成本低的优势，结果表明，这2种方法重复性理想，精密度高，所得数据无显著差异，均可作为蟾酥蛋白含量的测定方法。

综上所述，本实验可为蟾酥蛋白提取工艺和含量检测方法研究提供参考，也能为其蛋白纯化和活性功能考察提供依据。