糖尿病视网膜病变生物标志物的表达与测定

蒋依琳 综述 张晓敏 李筱荣 审校

天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼视光学院 天津医科大学眼科研究所 天津市视网膜功能与疾病重点实验室 天津市眼科学与视觉科学国际联合研究中心，天津 300384

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见的血管并发症，也是常见的致盲眼病之一。调查显示，2013年我国DR患者人数已超过1亿，成为严重的公共卫生问题[1]。一般认为，糖尿病患者体内长期持续的高血糖环境是触发血管功能障碍的关键因素，而炎症介质的出现和血管生成相关因子间平衡的破坏可进一步推动疾病的发展，最终导致糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)和增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。由于DR在病变前期存在一定隐匿性，导致很多患者就医时病情已到中晚期，视力受到不可逆损害，治疗预后情况并不理想，因此，实现DR的早期诊断及治疗具有重要的临床意义。生物标志物主要指可以客观测定和评价生物普遍生理、病理过程或治疗反应的某种特征性指标，通过对其测定可以获知机体当前所处生物学过程的方向与进程。随着生物标志物相关研究的快速发展，其在疾病的风险评估、早期诊断及治疗等方面发挥了重要作用。近年来，随着生物组学和人工智能(artificial intelligence，AI)的发展，DR发生和发展中生物标志物的研究日新月异。本文就DR发生与发展中相关生物标志物表达和测定方法进行综述，为更加有效地控制其发生和发展提供新思路。

1 血液及眼部组织中DR生物标志物的表达

1.1 糖化血红蛋白

DR的发生和发展与血糖控制情况密切相关。糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c，HbA1c)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物，可有效反映血糖控制水平，是糖尿病经典的生物标志物。Lind等[2]研究发现，DR患者患病前2～3年的HbA1c水平与当前DR进展的相对危险度关系最为密切。Nordwall等[3]对1型糖尿病患者随访20余年发现，HbA1c水平控制在<7.6%可有效预防DR。然而有研究表明，仅有11%的DR与HbA1c有关[4]。因此，HbA1c并非判断DR发展的理想生物标志物。

1.2 炎症类生物标志物

1964年，Powell等[5]发现，患有风湿性关节炎的糖尿病患者接受高剂量水杨酸盐类药物治疗后，DR发病率远低于预期，这一发现首次显示炎症与DR的发展相关。自此，研究人员陆续在DR患者的玻璃体、视网膜、泪液和血液等样本中发现诸多炎症相关因子表达异常。炎症可能是引起DR一系列复杂病理过程的刺激因素和各种致病机制发挥作用的共同途径[6]。

EURODIAB前瞻性并发症研究结果显示，C反应蛋白、肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎症因子水平与1型糖尿病中微血管并发症和心血管疾病密切相关[7]。江志坚等[8]研究发现，糖尿病患者血清S100A8/A9质量浓度与血清超敏C反应蛋白质量浓度呈正相关，其可能参与糖尿病微血管病变的发生和发展。Costagliola等[9]研究发现，泪液中TNF-α水平与DR严重程度高度相关。TNF-α可促进白细胞与血管内皮细胞的不可逆黏附，增加内皮细胞通透性，参与血-视网膜屏障的破坏，可作为PDR发病的预测因子[10]。另有一些研究发现，DR患者房水、玻璃体及血浆中IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17及IL-37水平升高，其在视网膜内皮细胞凋亡、DME、血-视网膜屏障破坏、视网膜神经元凋亡和视网膜血管生成过程中均发挥一定作用，促进DR的进展[11-13]。

此外，Geng等[14]对中国糖尿病患者进行研究发现，甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)引发的炎症及补体活化可能与糖尿病的血管并发症有关，DR患者较糖尿病非视网膜病变患者血清MBL水平明显升高，推测血清中MBL含量可作为中国人群DR的生物标志物。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可通过介导促炎细胞因子的产生从而激活炎症反应，导致内皮细胞功能障碍[15]。有研究表明，糖尿病患者和糖尿病动物模型的血清、玻璃体及视网膜中Hcy均显著升高，Hcy有望成为DR的筛查和诊断指标，提高Hcy清除率可靶向预防及治疗DR[16]。

1.3 血管生成类生物标志物

视网膜新生血管的出现预示着DR由非增生性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)发展为PDR。及早监测引起新生血管生成的因素并尽早控制可有效延缓PDR的进展，保护患者视力。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(主要是VEGF-A)是控制血管生成的主要因子，无DR的糖尿病患者眼部VEGF水平较低，而DR患者玻璃体及泪液中VEGF水平升高且与DR严重程度呈正相关[17-18]。抗VEGF治疗是目前临床治疗DR的主要手段。然而，DR临床研究显示，仅抑制VEGF不足以完全阻止视网膜新生血管形成，这提示其他因子也参与这一过程[19]。促红细胞生成素是一种糖蛋白激素，对血管内皮细胞具有调节作用，是一种强效的缺血诱导血管生成因子，在PDR视网膜新生血管生成过程中独立于VEGF发挥作用[20]。此外，低氧诱导因子1、血小板源性生长因子B、胎盘生长因子、血管生成素2等均在DR患者玻璃体及视网膜组织中表达升高，参与新生血管形成[21]。

正常生理状态下，组织内的促血管生成因子和抗血管生成因子之间保持稳态平衡，共同维持血管的健康状态。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是最有效的天然抗血管生成因子[22]。多项研究表明，DR患者尤其是PDR患者房水和玻璃体液中PEDF水平降低[23-25]。房水和玻璃体液PEDF浓度变化可能在DR进展中具有一定预测价值。

1.4 DR生物标志物在组学分析中的表达与测定

随着测序技术、质谱分析技术和生物信息学等组学技术的发展，实现了基因组学、蛋白组学和代谢组学的快速高通量分析，这为了解疾病进程和发现生物标志物提供了极大便利。

1.4.1基因组学类生物标志物 研究表明，DR是一种多基因相关性疾病，存在明显的家族聚集性，且其易感性与等位基因变异相关[26-27]。基因组学有助于揭示遗传因素对DR的影响，为DR生物标志物的研究提供了新方向。全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)通过在整个基因组中筛选单核苷酸多态性来识别与复杂疾病相关的数百种遗传变异。GWAS已被用于多个人群以识别DR相关风险基因[28-30]。其中，GRB2基因附近的遗传变异已被发现与DR存在显著相关性，且该变异为首个在多个研究队列中可重复的研究成果[31]。下一代测序技术可对候选基因、全外显子组或全基因组DNA中的每个核苷酸进行测定，其中，全外显子组测序可有效帮助解释遗传学在DR中的作用。目前，共2项DR相关全外显子组测序研究。Shtir等[32]以糖尿病史达10年但未出现DR者为试验组、以DR患者为对照组进行研究，发现NME3、LOC728699、FASTK基因罕见变异可在一定程度上阻止DR出现。Ung等[33]采用类似的研究方法对DR发病机制进行探索，发现高血糖环境对VEGFB、VPS13B、PHF21A、NAT1、ZNF600、PKHD1L1表达的抑制在DR发展中起重要作用。哈佛大学乔斯林糖尿病中心与新墨西哥医学院联合开展了DR遗传学研究，利用全外显子组测序技术对DR进行炎症和血管生成途径相关基因和变异的全面基因组学研究，发现KLF17、ZNF395、CD33、PLEKHF5、COL18A1参与DR进展，NKX2.3则起保护性作用[34]。

1.4.2微小RNA类生物标志物 微小RNA(microRNA，miRNA)为非编码RNA，可通过与mRNA结合控制转录后基因表达，促进mRNA降解和抑制蛋白翻译。研究表明，miRNA参与DR视网膜新生血管形成和炎症反应[35-36]。Helal等[37]研究发现，血清miR-146a和miR-21的表达量与DR严重程度呈正相关，miR-34表达量则随DR进展而降低，三者可成为DR诊断和预后的生物标志物。Liang等[38]研究发现，与2型糖尿病无DR患者相比，DR患者血清中let-7a-5p、miR-novel-chr5_15976及miR-28-3p均显著上调。Chen等[39]利用测序技术鉴定房水样本发现，与无DR糖尿病患者相比，PDR患者房水miR-150-5P及miR-93-5p含量显著降低，二者有望成为PDR生物标志物。Mazzeo等[40]分离健康者、无DR糖尿病患者和DR患者血浆细胞外囊泡，利用流式细胞仪和微阵列分析技术测定其内miRNA含量，发现DR患者miR-150-5p含量显著降低，miR-21-3p及miR-30b-5p含量显著升高，三者可作为DR潜在生物标志物。目前已鉴定出miR-126、miR-3197及miR2116-5p等多种miRNA含量在DR进程中发生显著变化并可作为DR生物标志物[41-42]。了解miRNA在DR中的作用有助于开发靶向调节miRNA的疾病治疗新策略。

1.4.3蛋白质组学类生物标志物 蛋白质组学的不断发展让我们能够在更短的时间内识别和分析更多蛋白质、揭示蛋白质功能和相互作用规律，有助于疾病诊断生物标志物和治疗靶标的探索。目前，通过高通量蛋白质组学技术对泪液、房水、玻璃体、视网膜及血液等样本进行分析，已发现多个在DR患者与无DR的糖尿病患者间有重要意义的差异蛋白。其中载脂蛋白和晶状体蛋白等已成为诊断DR的潜在生物标志物，视黄酸受体反应蛋白2、轴突生长导向因子4B、载脂蛋白B、热休克蛋白70等有望成为PDR防治的新靶点[43]。

1.4.4代谢组学类生物标志物 代谢组学是新兴的组学领域，可检测体内核酸、蛋白质、脂质等全部内源性代谢物的整体动态变化，是基因组学、转录组学和蛋白质组学数据的补充，有助于更好地识别生物标志物、了解疾病进程和探索新的药物靶点[44]。血浆代谢组学可揭示DR进展代谢谱[45]。Barba等[46]发现PDR患者玻璃体中乳酸和葡萄糖含量较高，而半乳糖醇和抗坏血酸含量显著降低。Paris等[47]揭示了PDR患者玻璃体氨基酸、酰基肉碱、嘌呤代谢受到严重损害的代谢特征，PDR患者和氧诱导视网膜病变小鼠模型玻璃体样本均显示精氨酸-脯氨酸通路活性增强，且该通路可作为DR治疗靶点。Haines等[48]研究发现，DR患者玻璃体黄嘌呤水平降低，氧化反应产生的肌苷、次黄嘌呤、尿酸盐、尿囊酸盐水平升高。Chen等[49]利用血浆样本首次发现DR患者2-脱氧核糖酸和3,4-二羟基丁酸水平升高，且二者可作为DR生物标志物，同时强调磷酸戊糖途径代谢失调与DR密切相关。Rhee等[50]发现，与无DR的糖尿病患者相比，DR患者血浆谷氨酰胺含量升高、谷氨酸含量降低，二者及其比值可作为DR生物标志物。Sumarriva等[51]发现，相比于NPDR患者，PDR患者血浆脂肪酸代谢发生明显改变。

2 DR生物标志物在影像分析中的表达与测定

2.1 影像学生物标志物

影像学技术的不断革新推动着DR生物标志物由有创向无创的方向发展。近年来眼科影像学一些特征性指标已经被纳入到广义的生物标志物范畴。

Ribeiro等[52]提出应用软件分析视网膜的微动脉瘤(microaneurysm,MA)周转率，即微动脉瘤生成和消失的速率，预测NPDR患者发展为DME的风险，MA周转率越高，患者进展为DME的可能性越大。Pappuru等[53]的研究结果也强调了MA周转率在识别DR进展中的重要作用。Santos等[54]将谱域光相干断层扫描(spectral domain optical coherence tomography,SD-OCT)与多焦视网膜电图联合应用以评估视网膜的结构和功能，SD-OCT显示的黄斑神经节细胞层-内丛状层、视盘周围神经纤维层变薄以及多焦视网膜电图提示的P1振幅下降、P1潜伏时间延长均出现在DR早期，甚至早于糖尿病患者出现明显眼底异常，二者结合可用于糖尿病患者DR筛查及早期诊断。OCT血管成像可较早发现黄斑中心凹无血管区(foveal avascular zone,FAZ)面积扩大、脉络膜新生血管早期征象等DR发生和发展标志，可用于DR筛查以及抗VEGF治疗后的动态观察[55]。

2.2 AI在生物标志物诊断分析中的应用

近年来，随着计算机数据分析能力的革新、算法研究的进展以及互联网大数据平台的普及，AI成为医学辅助诊断领域的研究热点。眼科AI技术将基于影像学资料建立的数据库与深度学习(deep learning，DL)算法结合，可对FAZ面积、血管、MA等眼部特征性生物学结构进行自动定量测量和分析[56]，快速筛选和捕捉异常的生物标志物并对疾病进行辅助诊断。Gulshan等[57]建立了由12.8万幅彩色眼底像组成的大数据集训练DL算法，用于检测DR，结果显示，该系统敏感性和特异性分别达97.5%和96.1%，诊断准确度与眼科专家持平。Li等[58]利用DL算法和彩色眼底照片开发的自动评分系统，可用于检测威胁视力的DR，其敏感性和特异性分别达97%和91.4%。Ting等[59]构建了新加坡、中国、美国、墨西哥等6个国家正常人及不同程度DR患者的眼底照片数据集，评估DL系统的DR诊断性能，结果显示，DL系统的敏感性和特异性分别为90.5%和91.6%。随着DR筛查系统的不断发展，AI的应用有望结合影像学标志物以外更多的生物标志物资料、节约社会成本、提高DR早期筛查效率。

3 总结与展望

近年，DR相关生物标志物的研究发展迅猛，一部分证据较充分的标志物如HbA1c、VEGF等和一些无创的影像类指标等均已应用于临床，并在DR的风险评估、尽早发现、进展预防、治疗干预等方面发挥了不可代替的作用。但很多DR生物标志物还处在研究阶段，有待进行更深入的了解。

理想的DR生物标志物应该具备创伤小、便捷、经济、特异性高和可重复性强等特点。目前，DR发生与发展中相关生物标志物的研究仍面临着样本量需求大、需在不同人群中进行验证、缺乏统一量化标准以及分析技术耗时长、成本高等难题。未来，随着医学与技术的不断发展和科研工作者的不懈努力，将会有更多的理想生物标志物更广泛应用于临床，实现DR早期发现和早期治疗，从而降低DR的致盲率。

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