肛门失禁动物模型基因转录组学分析

路 明，刘 扬，刘 青，黄克林，洪 文，杨 博

(新疆医科大学第一附属医院肛肠科，乌鲁木齐 830054)

大便失禁(Fecal incontinence)又称肛门失禁(Anal incontinence)[1]，是指肛门括约肌对气体及粪便的控制能力减弱或消失，导致患者不自主地排泄粘液、液体或固体的粪便，且至少持续三个月，严重影响患者的生活质量。目前，大便失禁的发病率仍无统一的结论，但该疾病发病率随着年龄增长逐渐增高[2]。本研究以外伤性肛门失禁为切入点，基于转录组学测序技术，分析手术离断括约肌导致肛门失禁动物模型的转录组学特征，为进一步探索肛门失禁的发生发展机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组选取成年SPF级长白猪8只，4周龄，体重(19～23)kg，采用随机数字表法分为空白组、肛门失禁动物模型组(模型组)，每组4只。动物由新疆医科大学动物实验中心提供，实验已通过新疆医科大学实验动物伦理委员会批准(审批号：20201016-221)。

1.2药物、试剂与仪器TRIZOL(美国Ambion公司，货号：15596-018)；Glycogen(美国Thermo公司，货号：R0561)；辅酶1(RQ1)(美国Progema公司，货号：M6101)；异丙醇(美国Invitrogen公司，批号：00833282)；无水乙醇(批号：20181025)、醋酸钠(批号：20210402)均购自国药集团化学试剂有限公司；RNA逆转录试剂盒(批号：A3A0289)、PCR 试剂盒(批号：A3A0690)均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。低温台式离心机(德国Eppendorf公司，型号：5415R)；电泳槽(型号：DYCP-31DN)、电泳仪电源(型号：DYY-7C)均购自北京六一公司；凝胶成像仪(美国Bio-rad公司，型号：Dr-EZ)；超微量分光光度计(美国Thermo公司，型号：Nanodrop2000)。

1.3动物模型[2]的创建采用静脉麻醉对所有实验动物进行麻醉处理，截石位：3点或9点处纵形切开内外括约肌，以手术离断括约肌导致肛门括约肌损伤的方式构建肛门失禁模型，间断缝合创面，要保持创面整齐，利于创面愈合。术后给予二代抗生素预防感染。成功造模后，对模型组长白猪每日设定进食及饮水量，观察长白猪的排便情况。

1.4RNA-Seq转录组学测序[3]分析麻醉所有实验动物，取出肛门括约肌，用RNA later保存，由武汉瑞兴生物科技有限公司进行RNA提取和RNA-Seq测序。用RQ1酶处理总RNA，去除DNA。在260 nm/280 nm (A260/A280)处测量吸光度，测定纯化RNA的质量和数量。每个样本使用1 μg总RNA，通过Illumina平台KAPA-Stranded mRNA-Seq Kit (KK8 544)制备RNA-Seq库。用VAHTS mRNA捕获珠(N401-01)和片段纯化多聚腺苷化mRNA，并转化为双链cDNA。在末端修复和A拖尾后，将DNA连接到稀释的Roche adaptor (KK8726)上。连接产物纯化后，分馏至产物大小约300～500 bps后，扩增、纯化、定量，-80℃保存，并测序。带有dUTP标记的链(第二个cDNA链)不被扩增，允许其特异性测序。对于高通量测序，应用文库Illumina Nova-Seq 6 000系统进行150 nt对端测序。项目物种为猪(Pig)，参考基因组版本为Sus_scrofa.Sscrofa11.1，采用从头测序、同源预测和基于RNA-Seq的证据支持预测相结合的方法，利用物种已发表的基因序列、蛋白质序列、mRNA序列构建物种的基因结构模型。利用生物信息学分析进行拼接、组装，获得该物种的基因组序列图谱，利用RNA-Seq数据，通过Tophat对比，得到基因组的内含子结构模型及基因侧翼序列信息，最后对上述方法预测的结构模型进行整合和优化，获得最终的基因结构模型。

1.5GO富集分析和KEGG富集分析[4-5]对转录组学测序所得的原始数据进行过滤筛选，设定阈值为显著性水平P<0.05和差异倍数(Fold change，FC)≥2，对所有样品中的mRNA进行差异基因的筛选，差异基因分析参考见图1。采用基因本体分析(Gene ontology，GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析对差异表达基因相关功能和信号通路进行分析。

1.6统计学处理选用软件DESeq2对原始Reads进行建模，使用标准化因子(Scale factor)来解释库深度差异,并估计基因离散度，缩小估计值以生成准确的离散度估计，从而对读取计数(Reads count)进行建模。最后拟合负二项分布的模型，并使用Wald检验或似然比检验进行假设检验，分析两个或多个样本间的差异表达，分析结果以差异倍数(Fold change，FC)和假发现率(False discovery rate，FDR) 表示。显著差异表达评判标准为FC≥2或≤0.5，FDR<0.05。

2 结果

2.1两组差异表达基因分析RNA-Seq测序结果表明，模型组和空白组的肛门括约肌组织差异表达基因共有431个，其中上调基因280个，下调基因151个(图2，表1、2)。

表1 模型组肛门括约肌组织中前10个上调表达基因

表2 模型组肛门括约肌组织中前10个下调表达基因

2.2GO富集分析结果GO分析结果显示，上调基因主要与免疫反应、抗原处理和提呈、对病毒的防御反应、趋化性、对细菌的反应、细胞增殖和细胞迁移等生物功能相关。下调基因主要与DNA模板转录正调控、基因表达负调控、凋亡过程的负调控和氧化应激反应等生物功能相关。

2.3KEGG分析结果KEGG分析结果显示，上调基因主要与金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮、抗原处理和提呈、甲型流感、结核病和百日咳等通路相关。下调基因主要与PPAR信号通路、脂肪酸代谢、血管平滑肌收缩、不饱和脂肪酸的生物合成、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路和催产素信号通路相关。

3 讨论

目前，肛门失禁的基础研究较少，本研究通过动物实验寻找肛门失禁的基因表达变化，以期为肛门失禁的基础研究搭建研究平台和方向[6-7]。因猪和人的基因具有高度同源性，可作为研究对象。本研究在猪肛门失禁的肛门括约肌组织上运用RNA-seq技术[8-9]解析肛门失禁转录组学特征。转录组学分析表明，猪肛门失禁动物的肛门括约肌组织中有280个上调表达基因，151个下调表达基因，其基因表达模式不同于正常肛门括约肌组织。其中，OBSCN基因上调表达倍数最高。有研究表明，OBSCN基因编码的obscurin蛋白能够与肌联蛋白作用，参与肌节形成和肌浆网结构的维持，该基因突变是导致心肌病发生的重要因素之一[10]。可推测该基因可能有参与肛门括约肌的修复过程。亦有研究表明，哮喘患者支气管黏膜中 CCL26 表达显著增高，提示CCL26参与了气道括约肌的重塑和形成[11]。而本研究中CCL26基因上调倍数较高。因此可推测在肛门失禁肛门括约肌的重塑过程中，CCL26的表达起到了重要作用。

GO[12]和KEGG分析均提示免疫反应在手术离断括约肌致猪肛门失禁动物模型的肛门括约肌组织中发挥了重要作用。既往学者认为，Th1/Th2细胞功能失调导致免疫功能下降，外源性致敏原被抗原递呈细胞吞噬并激活T细胞，产生大量炎性因子及多种活性物质，导致直肠肛管肌细胞分泌物增多，引发临床症状，免疫功能下降亦可活化辅助性Th2细胞，激活免疫细胞聚集，吞噬炎性细胞，同时释放出多种炎性介质、细胞因子等[13-14]。提示免疫系统在此过程中发挥了重要的保护作用，以防止细菌和病毒等外源感染。因此，临床相关手术应重视防治感染的发生，以促进术后恢复。

综上所述，OBSCN等上调基因可能在肛门失禁的括约肌组织中具有重要作用，这为阐明肛门失禁的致病机制奠定了实验基础。