不同生长阶段呼伦贝尔羊3种脂肪组织中膻味脂肪酸含量的变化规律研究

欧慧敏 张小丽 钟荣珍 李建中 谭支良 许丽卫 焦金真*

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室，长沙 410125；2.湖南师范大学生命科学学院，动物肠道功能湖南省重点实验室，长沙 410081；3.中国科学院东北地理与农业生态研究所，吉林省草地畜牧重点实验室，长春 130102)

我国是养羊大国，2020年我国羊存栏量为30 654.8万头，稳居世界首位，但是羊肉消费量仅为492万t，占全部肉类消费的6%，远低于15%的世界平均水平。羊肉风味是决定人们对羊肉接受度的重要因素，部分消费者因其独特的膻味而拒绝接受羊肉，因此降低羊肉膻味物质含量有望改善人们对羊肉的接受度，进而促进羊肉的消费和养羊产业的快速发展[1]。羊肉膻味主要来源于不同类型脂肪组织的脂肪酸，其中3种4-烷基支链脂肪酸，即4-甲基辛酸(4-methyloctanoic acid，MOA)、4-乙基辛酸(4-ethyloctanoic acid，EOA)和4-甲基壬酸(4-methylnonanoic acid，MNA)是导致羊肉产生膻味的主要脂肪酸[2-3]。目前研究表明，这些膻味脂肪酸组成成分复杂，虽然含量极少，但功能强大，其含量的变化将直接影响羊肉膻味的强弱。

众所周知，呼伦贝尔羊生存在空间系无污染的内蒙古大草原，自然放牧模式使羊肉具有口感细嫩、多汁味美、膻味低的特点。但是舍饲或半舍饲快速育肥作为现如今养羊产业的主流模式，其虽能提高养殖效率，却使呼伦贝尔羊的膻味程度明显增加[4]，从而在一定程度上影响了人们对呼伦贝尔羊肉的消费需求。张志超等[5]的研究已证实，3岁呼伦贝尔大尾羊的膻味脂肪酸MOA和EOA的含量均显著高于8月龄羊，且MNA含量只能在3岁羯羊中被检测到。随着动物年龄的增长，膻味脂肪酸在脂肪组织中逐渐沉积，但在呼伦贝尔羊中是否也存在这一相同的变化规律目前并不清楚，也少有系统的研究。因此，探索不同生长阶段呼伦贝尔羊的膻味脂肪酸含量的变化规律，对改善羊肉膻味尤为重要。本研究以酸碱法甲酯化处理为前提，结合气相色谱-质谱联用法，对不同生长阶段(新生期、断奶期、育肥中期和后期)呼伦贝尔羊3种脂肪组织(背部皮下脂肪、肾周脂肪和肠系膜脂肪)中的3种膻味脂肪酸(MOA、EOA和MNA)含量进行了测定和比较分析，旨在明确呼伦贝尔羊不同生长阶段脂肪组织中膻味脂肪酸含量的变化规律，为后续改善羊肉风味提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

本试验中动物试验的所有程序遵循《实验动物管理与使用指南》要求，由中国科学院亚热带农业生态研究所动物伦理委员会批准动物的使用。在呼伦贝尔市鄂温克旗中国科学院草牧业工程试验站进行动物饲养试验。试验选择32只体况较好、初生重[(3.63±0.46) kg]相近的新生呼伦贝尔羊，随机选取其中8只新生期羔羊(出生1～2 d内)屠宰后采集脂肪组织样品，剩余24只羔羊随母羊生活。羔羊从6周龄开始补饲固体开食料，分别于08:00和16:00将羔羊单独关进补饲栏饲喂开食料，其余时间随母羊自由吮乳，直至2月龄断奶。断奶羔羊单笼饲养并饲喂固体开食料至3月龄，之后供给育肥料至6月龄。开食料及育肥料组成及营养水平见表1。动物饲养试验时间共180 d，在断奶期(2.5月龄)、育肥中期(5月龄)和后期(6月龄)各随机屠宰8只。

1.2 样品采集

宰前禁食24 h，禁水2 h，采用颈动脉放血的方式屠宰，屠宰后胴体沿脊柱劈开为左右两半，取背部皮下脂肪(第12～13肋骨处背部肌肉上方的脂肪组织)、肾周脂肪和肠系膜脂肪组织各80 g左右，装入保鲜袋中于-20 ℃冰箱冷冻保存。

表1 开食料及育肥料组成及营养水平(干物质基础)

1.3 主要试剂与仪器

MOA、EOA、MNA标准液(纯度≥98.0%，Sigma公司，美国)；甲醇、正己烷(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚、氢氧化钠、浓硫酸(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

冷冻干燥机(Scientz-18N，宁波新芝生物科技有限公司，中国)；配备有EI电离源、四级杆质量分析仪和自动进样器的7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS，Agilent，美国)；索氏提取仪(Gerhardt，德国)；0.22 μm滤膜(希波氏，中国)。

1.4 试验方法

1.4.1 脂肪的提取

取5 g左右冷冻干燥后的样品，用滤纸包好后放入索氏提取器中，以石油醚为溶剂，在60 ℃恒温条件下连续抽提2 h。用旋转蒸发仪除去提取物中的有机溶剂，得到透明浓稠状的粗脂肪油。

1.4.2 标准品溶液的配制

准确称取MOA、EOA和MNA各100 mg，混合并用正己烷定容至50 mL，即为脂肪酸标准溶液。准确量取标准溶液12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成的脂肪酸浓度分别为1、2、4、8和16 μg/mL梯度的混合标准溶液。

1.4.3 酸碱衍生法

准确吸取8 μg/mL脂肪酸标准溶液5 mL于150 mL锥形瓶中，加入5 mL 2%氢氧化钠-甲醇溶液摇匀，安装冷凝回流装置，置于75 ℃恒温水浴箱中回流20 min。再从冷凝管上端加入10 mL 0.5 moL/L硫酸-甲醇溶液，75 ℃水浴回流15 min，最后加入10 mL正己烷回流2 min。取出后冷却至室温，加入10 mL超纯水，在涡旋振荡仪上振摇5 min，静置分层后取上清液过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中待测。

1.4.4 GC-MS分析

检测条件为：SP-2560色谱柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm, Supelco，美国)；程序升温条件：140 ℃，保持5 min，然后以2 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；再以30 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；进样口：250 ℃；离子源：230 ℃；四级杆：150 ℃；质谱接口：220 ℃。流速：1.0 mL/min；进样量：1 μL；分流比：10∶1，选择离子扫描模式，定量离子选择m/z：MOA、EOA和MNA均为87，辅助定量离子均为74、57。

1.4.5 标准曲线、线性范围及检出限

将配制的系列标准品分别上机测定，以各目标物质的浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程；以目标物3倍信噪比的浓度为其检出限，10倍信噪比的浓度为其定量限。

1.5 数据统计与分析

试验数据利用SPSS 22.0统计软件的ANOVA过程进行非参数检验(k个独立样本检验)，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 呼伦贝尔羊不同生长阶段生长性能

呼伦贝尔羊的体重、体高和体长的增长主要发生在新生期～断奶期这一阶段(表2)，增长幅度分别达480%、240%和337%。从断奶期～育肥期，呼伦贝尔羊体重继续随日龄的增加而显著增加(P<0.05)，而体高和体长的增长幅度则低于14%，仅在育肥中期～育肥后期呼伦贝尔羊的体长显著增加(P<0.05)。

表2 呼伦贝尔羊不同生长阶段的生长性能

2.2 标准曲线、线性范围及检出限

MOA、EOA、MNA含量线性范围分别在0.35～16.00 μg/mL、0.20～16.00 μg/mL和0.20～16.00 μg/mL，线性关系良好，相关系数均达到0.998以上，检测限(RS/N=3)分别为0.10、0.05和0.05 μg/mL(表3)。

2.3 呼伦贝尔羊不同生长阶段3种脂肪组织中膻味脂肪酸的含量

2.3.1 背部皮下脂肪组织

不同生长阶段呼伦贝尔羊背部皮下脂肪组织中3种膻味脂肪酸MOA、EOA和MNA的含量存在显著差异(P<0.05，表4)，均表现为育肥后期>育肥中期>断奶期>新生期。其中，MOA和MNA的含量在育肥中期～育肥后期的增长速率最快，而EOA的含量在断奶期～育肥中期的增长速率最快。从数值上来看，除育肥中期外，其他3个生长阶段中3种膻味脂肪酸均以MOA的含量最高。

表3 MOA, EOA and MNA的线性方程及检出限

表4 呼伦贝尔羊不同生长阶段背部皮下脂肪组织中膻味脂肪酸的含量

2.3.2 肾周脂肪组织

由表5可知，不同生长阶段的呼伦贝尔羊肾周脂肪组织中的膻味脂肪酸(MOA、EOA和MNA)的含量均存在显著差异(P<0.05)，且变化趋势与背部皮下脂肪组织一致，均表现为育肥后期最高，新生期最低。在断奶期～育肥中期，肾周脂肪组织中的MOA和EOA的增长速率最快，育肥中期MOA、EOA的含量分别约是断奶期的3和4倍多；而MNA的含量则在育肥中期后快速增长，至育肥后期MNA的含量约增加3倍。与EOA和MNA含量相比，MOA的含量在4个不同生长阶段中均为最高，新生期其含量至少是MNA的2倍以上，而从断奶期开始其含量至少为MNA的4倍以上。

表5 呼伦贝尔羊不同生长阶段肾周脂肪组织中膻味脂肪酸的含量

2.3.3 肠系膜脂肪组织

由表6可知，新生期羔羊的肠系膜脂肪组织中MOA、EOA和MNA的含量极低，均未达到检测限；断奶期羔羊的肠系膜脂肪组织中的MNA也不能被检测到。育肥中期和育肥后期羊的肠系膜脂肪组织中MOA和EOA的含量均显著高于断奶期(P<0.05)，其含量均为断奶期的5倍以上。育肥中期和育肥后期的MNA的含量差异不显著(P>0.05)。在肠系膜脂肪组织中，MOA和EOA的含量在同一生长阶段均相差不大，而MNA含量仅为MOA或EOA含量的1/20。

表6 不同生长阶段呼伦贝尔羊肠系膜脂肪组织中膻味脂肪酸的含量

从脂肪组织部位差异性来看，4个不同生长阶段呼伦贝尔羊的3种膻味脂肪酸的含量均以背部皮下脂肪组织为最高。以育肥后期为例，背部皮下脂肪中的MOA、EOA、MNA的含量分别是肾周脂肪组织中的7.8、3.8和9.1倍。

3 讨 论

目前为止有关测定羊肉膻味脂肪酸含量方法的报道较少，以气相色谱法和气相色谱-质谱联用法最为常见。多项研究表明，膻味脂肪酸因具有极强的挥发性，导致常规检测方法无法准确定量分析[6]，通常情况下需将膻味脂肪酸通过甲酯化衍生成脂肪酸甲酯进行检测。李秋桐等[7]比较了不同脂肪酸甲酯化的方法，发现酸碱法和三氟化硼-甲醇法反应时间短、灵敏度高，所测得的色谱图峰形和分离度较好，整体效果优于1%硫酸-甲醇法，更能准确地测定羊肉中膻味脂肪酸的含量。最新研究也表明，酸碱法甲酯化效率总体上高于三氟化硼-甲醇法[8]，可作为定量检测膻味脂肪酸的首选方法[9]。因此，本试验结合酸碱法和气相色谱-质谱联用法，首先将不同部位的脂肪组织抽提出的脂肪经酸碱法衍生成脂肪酸甲酯，然后采用气相色谱-质谱联用法测定膻味脂肪酸的含量。结果表明，MOA、EOA、MNA的定量检测限分别为0.10、0.05和0.05 μg/mL，R2>0.998。Kaffarnik等[10]采用1%硫酸-甲醇法测定绵羊皮下脂肪组织膻味脂肪酸，MOA、EOA和MNA的定量检测限为3.6～4.8 μg/g，最低检出限为1.1～1.4 μg/g。这一结果远远高于我们的定量检测线，表明我们目前的研究方法灵敏度更高，可操作性更强，适用于呼伦贝尔羊脂肪中膻味脂肪酸含量变化规律的研究。

不同品种羊脂肪组织中膻味脂肪酸含量不同，也是影响羊肉膻味强弱的主要因素之一。一般绵羊中的膻味脂肪酸的含量低于山羊[7,11]，其中呼伦贝尔羊是典型的低膻味绵羊品种。本研究结果表明，呼伦贝尔羊脂肪组织的膻味脂肪酸中MOA的含量最为丰富，EOA和MNA的含量相对较低，这与前期研究结果[9,12-13]相一致，说明MOA和EOA是引起羊肉具有膻味的主要脂肪酸。另有研究报道，随着日龄的增加，羊肉中的膻味脂肪酸沉积量不断增长，表明年龄因素对羊肉膻味的形成和沉积具有重要影响[14-15]。Salvatore等[16]研究结果表明，羔羊中MOA和EOA的含量低于周岁羊和成年羊，但羔羊的MNA含量高于周岁羊和成年羊。青海黑藏羊背最长肌中MOA的含量随着年龄的增加而不断增加，而EOA的含量则表现出先增长后降低的变化趋势[17]。本研究结果发现，新生期的呼伦贝尔羔羊MOA、EOA和MNA含量，以及断奶期羔羊的MNA含量均未达到检测线，有可能是因为呼伦贝尔羊本身合成膻味脂肪酸的能力就很弱，而在新生期和断奶期羔羊合成膻味脂肪酸的能力甚至更弱。此外，本试验结果表明，3种膻味脂肪酸含量均随日龄增长而不断增加，且大多数膻味脂肪酸含量均在断奶期～育肥中期的增长速率最快，这一结果为后续的营养调控提供了关键理论支持。除了品种与年龄因素外，饲粮类型、添加剂、饲养方式等多种因素均可引起羊脂肪中的膻味脂肪酸含量的变化[18]。放牧羊皮下脂肪中膻味脂肪酸含量低于舍饲苜蓿组和玉米组，且玉米组的膻味脂肪酸含量高于苜蓿组[19]，其可能原因是高淀粉谷物经过瘤胃微生物发酵产生的丙酸可以作为合成支链脂肪酸的重要前体物质。本试验中新生期羔羊营养主要来源于母乳，断奶期羔羊营养来源于开食料(高蛋白质)，育肥中期和后期来源于育肥饲粮(高碳水化合物)。此营养来源的转变引起呼伦贝尔羊体内激素和代谢水平的差异，从而引起脂肪组织中膻味脂肪酸的含量和组成发生变化，进而产生不同程度的膻味[18,20]。

羊不同部位脂肪组织中的脂肪酸组成具有显著差异。李维红等[21]对靖远滩羊体脂脂肪酸的研究发现，短链脂肪酸的含量按照肾脏脂肪>背膘脂肪>尾部脂肪的顺序依次减少，膻味逐渐减轻。Brennand等[22]对羔羊不同部位组织中支链脂肪酸进行定量分析，发现其在皮下脂肪组织中含量较高，而在肾周脂肪和肌内脂肪中的含量相对较低。本研究结果表明，呼伦贝尔羊不同部位脂肪组织中3种膻味脂肪酸的含量按背部皮下脂肪>肠系膜脂肪>肾周脂肪的规律降低，这一结果与前人多项研究结果[23-24]相符。肉羊膻味脂肪酸在皮下脂肪组织中的沉积量普遍高于内脏脂肪组织，这种差异可能是由于脂肪酸合成路径(短链脂肪酸的从头合成和外源脂肪酸的直接摄取)在不同脂肪组织间有所不同所导致的[12]。总之，背部皮下脂肪组织中膻味脂肪酸含量较高，易于定量检测，可以作为后续有关呼伦贝尔羊膻味脂肪酸相关研究的首选部位。

4 结 论

呼伦贝尔羊3种脂肪组织中的膻味脂肪酸的含量随日龄增长而不断增加，且在断奶期至育肥中期的增长速率最快；背部皮下脂肪组织的膻味脂肪酸在整个生长期含量最高。