载有卵磷脂的纳米纤维膜的制备及其抗细胞黏附性能评价

曾羽佳， 毛 迎,b， 李 彦,b， 王 璐,b

(东华大学 a.纺织学院， b.纺织面料技术教育部重点实验室， 上海 201620)

腹腔粘连是腹膜创伤后的常见反应，是腹部手术后脏器与腹壁的病理性改变，表现为增生的纤维组织黏附到附近的正常器官，这是长期困扰外科领域的重要问题之一[1-2]。研究[3-4]表明，腹部手术后腹膜粘连率近80%，会导致肠梗阻、不孕及盆腔疼痛等严重后果。术后粘连的形成过程非常复杂，目前研究[1,5-6]认为，腹腔损伤、炎症及缺氧会改变腹腔内微环境，导致纤维蛋白沉积，形成疏松的粘连，进而成纤维细胞增殖，逐渐形成胶原后毛细血管长入其中，形成永久粘连。

目前，物理屏障是较为常见的防粘连方法，通过物理阻隔作用隔离手术创面与其他组织，从而预防腹腔粘连的形成[7-8]。然而材料植入体内后与生物组织发生反应，蛋白质会迅速沉积在材料上，进而使细胞组织在其表面黏附增殖，影响植入物理屏障的防粘连作用。理想的防粘连膜需要有可降解性，研究[3,9]表明从腹膜损伤到完全修复至少需要8 d，现有商用防粘连膜降解时间为1 ～4星期不等。商用防粘连膜多为致密结构，而静电纺膜相比致密膜具有高孔隙率，有利于伤口产生的液体渗出及营养物质的运输，同时具有的小孔径可防止细胞长入[10-11]。为提升纤维膜的防粘连性能，有学者将功能性试剂添加至纤维膜中。Mao等[12]研究表明，负载布洛芬的聚乳酸-乙酸共聚物/聚己内酯电纺膜具有良好的抗细胞黏附效果；Li等[6]研究表明，加入聚乙二醇的聚乳酸-乙酸共聚物混纺膜具有良好的抗细胞黏附性。但上述研究中，药物的使用易产生不良反应，聚乙二醇易被水解洗脱，存在抗黏附效果不稳定等问题。因此，制备一种稳定可持续防粘连的物理屏障是防粘连领域的研究重点之一。

材料表面的蛋白吸附为细胞黏附提供了条件，两亲性物质被证实可修饰于材料表面，从而形成水化层阻碍蛋白与材料表面的直接接触，进而减少蛋白黏附[13-14]。卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)是细胞膜的主要成分，具有两亲性[15-16]。廖祝胜[17]研究表明，经过PC改性的聚乙烯膜可展现出良好的抗蛋白吸附能力，因而推测PC有作为抗细胞黏附的功能试剂的潜力。聚乳酸(polylactic acid，PLA)是一种可降解材料，细胞亲和力较低，有利于防止细胞黏附[18]。但PLA降解时间较长，在PLA中添加聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)可调节PLA的降解速率，在保证总体降解量的同时提供有效时间内必要的力学性能[19-20]。

综上，考虑到具有两亲性的PC可在共混材料中均匀分布，有望在防粘连膜植入人体后PC仍保持稳定的亲水性。因此，本文选用PC作为添加剂，以PGA/PLA为基材，利用静电纺丝法制备纤维膜，以期该纤维膜在防粘连方面获得应用。通过调整PC在PGA/PLA纺丝液中的比例，制备4种具有不同PC含量的纤维膜，研究分析添加PC对复合纤维膜的力学性能、润湿性、降解性能及抗细胞黏附性的影响。

1 试验部分

1.1 试验材料与仪器

PLA(相对分子质量Mw=8万，罗恩试剂)，PGA(Mw=15万，上海麦克林)，六氟异丙醇(HFIP，纯度≥99.8%，上海阿拉丁)，PC(纯度>90%，上海麦克林)，氯化钠(NaCl，优级纯，国药集团化学试剂有限公司)，氯化钾(KCl，优级纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钠(Na2HPO4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(KH2PO4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，小鼠成纤维细胞(L-929，中国科学院上海细胞库)，细胞计数试剂盒(CCK-8试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司)，DMEM培养基(Gibco)，胰酶(Trypsin-EDTA，0.25%，Gibco)，胎牛血清(FBS，Gibco)，DAPI染液(上海翊圣生物科技有限公司)，青霉素-链霉素(美国Thermo)，4%多聚甲醛(上海翊圣生物科技有限公司)。

静电纺丝机(ET-2535H型，北京永康乐科技发展有限公司)，电子天平(FA2204C型，上海赛德利思精密仪器仪表有限公司)，恒温磁力搅拌器(524G型，上海梅颖仪器仪表制造有限公司)，场发射扫描电镜(SU8010型，日本日立)，医用纺织品多功能强力仪(YG(B)026G-500型，大荣仪器)，台式乳胶测厚仪(CH-12.7-BTSX型，上海添时科学仪器有限公司)，接触角测试仪(OCA20型，德国DATAPHYSICS公司)，傅里叶变换红外光谱仪(Spectrum Two型，珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司)，酶标仪(M200型，瑞士Tecan)，荧光倒置显微镜(Nikon Ti-s型，日本日立)。

1.2 试验方法

1.2.1 纺丝原液的配制

称取不同质量的PGA、PLA、PC溶解于HFIP中，室温下置于磁力搅拌器搅拌12 h至溶解并完全混合均匀。PGA、PLA、PC混合溶液中各成分含量如表1所示。

表1 PGA/PLA/PC混合溶液中各成分的含量

1.2.2 混纺膜的制备

将配制的纺丝原液注入10 mL的注射器中进行静电纺丝，用铝箔纸接收纳米纤维。纺丝参数：纺丝速率为1 mL/h、纺丝电压为15 kV、接收距离为15 cm、纺丝温度为30 ℃、纺丝相对湿度为50% ～65%、针头型号为20 G。纺丝结束后，取下接收板上的铝箔纸，在真空干燥箱中于40 ℃下烘干12 h以去除残留的溶剂。

1.3 结构与性能测试

1.3.1 表面形貌

将复合纤维膜裁剪合适大小后用导电胶贴在电镜台上并喷金，使用场发射扫描电子显微镜观察纤维形貌。使用图像分析软件Image J测量100根不同纤维直径并进行分析，以获得纤维平均直径及其分布。

1.3.2 红外测试

采用红外光谱仪对各复合纤维膜表面的化学键类别与分布进行测试分析，扫描波数为4 000～400 cm-1。

1.3.3 力学性能

将复合纤维膜裁剪成30 mm×10 mm的矩形，室温下用多功能强力仪测量各复合纤维膜的断裂强度和断裂伸长率。设置初始隔距为20 mm，拉伸速度为10 mm/min，预加张力为0.1 N，每个试样测量3次。采用台式乳胶测厚仪测量复合纤维膜的厚度，测量3次求取平均值，并绘制应力-应变曲线。

1.3.4 水接触角

对各复合纤维膜进行静态水接触角测试。使用去离子水，体积为2 μL，滴加速率为2 μL/s，水滴接触纤维膜后静置30 s，分别测量水滴接触纤维膜1、5、10、30 s后的接触角，每种试样随机取3个点测量并取平均值。

1.3.5 降解性能

使用磷酸缓冲盐(PBS)溶液模拟人体内降解环境，称取8.0 g NaCl、0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4、0.2 g KCl溶解于800 mL去离子水中，充分搅拌后调节pH值至7.4，定容为1 000 mL，以备使用。

将复合纤维膜裁剪成20 mm×80 mm的矩形，烘干称量后放入离心管中，每个离心管加入30 mL PBS溶液，置于37 ℃恒温摇床中，隔天换液，第4、7、14、21、28 d取出，冷冻干燥后计算复合纤维膜剩余质量分数(w)，计算式如式(1)所示。

(1)

式中：m0为复合纤维膜的初始质量；m1为复合纤维膜降解后质量。

对部分样品拍摄电镜照片以观察其形貌以及测量降解后纤维膜的力学性能，操作步骤及参数同第1.3.1、1.3.3节。

1.3.6 抗细胞黏附试验

(1)材料准备。将纤维膜裁剪成直径为14 mm的圆片，每种试样准备3个平行样放置于24孔板内，用灭菌后的不锈钢钢环固定，放入酒精蒸缸内24 h，然后转移至超净台内放置，用PBS溶液清洗3次。

(2)细胞培养与种植。将L-929细胞置于含89%DMEM、10%胎牛血清和1%双抗的完全培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当培养至所需数量后种植在样品上，细胞种植密度为每孔2×104个，在培养箱中分别培养1、3、5 d，隔天换液。

(3)细胞增殖定量测试。采用CCK-8法检测细胞增殖。避光配制含90%DMEM、10%CCK-8的CCK-8工作液，细胞培养到预定时间后去除培养基，添加PBS溶液清洗细胞3次以除去未贴壁的游离细胞，然后每孔避光加入500 μL CCK-8工作液，放入37 ℃恒温培养箱中培养3 h后吸取上清液至96孔板中，每孔容量为100 μL。然后使用酶标仪测定上清液在450 nm处的吸光度值,并且按式(2)计算细胞增殖率。

(2)

式中：R为细胞增殖率；a为不同时间点试验组的吸光度值；b为培养时间最长的空白对照组的吸光度值。

(4)DAPI荧光染色。为了更好地直接观察细胞黏附情况，采用DAPI染液对细胞核染色，对细胞进行染色观察。将培养细胞的培养基吸出，经PBS溶液漂洗3次后，加入500 μL质量分数为4%的多聚甲醛将细胞固定1 h，吸除多聚甲醛后用PBS溶液浸洗3次，使用0.5%Triton X-100通透5 min，然后用PBS溶液再浸洗3次，每孔避光加入200 μL的DAPI，孵育5 min，用PBS溶液浸洗3次洗去多余的DAPI。选用洁净的盖玻片，将有细胞的一面贴于盖玻片表面置于荧光显微镜下观察，以合适倍数拍摄。

2 结果与讨论

2.1 形貌分析

混合不同质量浓度PC的PGA/PLA纤维膜SEM图及纤维直径分布图如图1所示。由图1可知，添加不同质量浓度PC的PGA/PLA混合纺丝液均能形成均匀完整、表面无串珠、无规律分布的纤维膜，纤维直径随PC质量浓度的增加而增加，0PC、2.5PC、5PC、10PC样品的纤维平均直径分别为300、310、350、410 nm，且10PC样品中出现了纤维轻微黏结现象。该现象主要归因于PC含有亲水的磷酸基，易吸收空气中的水分，当PC在纤维膜中的占比增大时，纺丝过程中溶剂的挥发受到了抑制，因此造成纤维因溶剂残留而发生黏结。

图1 PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜的SEM图及纤维直径分布Fig.1 SEM images and fiber diameter distribution of PGA/PLA composite fiber membranes with different mass concentrations of PC

2.2 红外分析

图2 PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜的傅里叶变换红外光谱Fig.2 Fourier transform infrared spectra of PGA/PLA composite fiber membranes with different mass concentrations of PC

2.3 力学性能分析

作为防粘连膜使用时，纤维膜需要具备一定的力学性能，因此对含不同质量浓度PC的PGA/PLA复合纤维膜力学性能进行研究。图3(a)为含不同质量浓度PC的PGA/PLA复合纤维膜应力-应变曲线，图3(b)为各纤维膜的断裂强度与断裂伸长率。由图3可知，PC的加入显著影响复合纤维膜的断裂强度和断裂伸长率，0PC和2.5PC样品的断裂强度分别为4.97和3.52 MPa，但随着PC质量浓度的增加，纤维膜的断裂强度逐渐提高。这可能是由于纤维的直径有所增大，纤维膜中存在的黏结有效提高了纤维间的相互作用。同时加入PC越多，复合纤维膜的断裂伸长率越小。力学测试结果表明，PC的加入降低了PGA/PLA复合纤维膜的力学性能。这可能与PGA/PLA聚合物的含量下降有关，但断裂强度最低的2.5PC样品纤维膜所能承受的断裂强度也高于人体在运动时33.6 kPa的腹内压强[21-22]。

图3 PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜应力-应变曲线图及断裂强度与断裂伸长率Fig.3 Stress-strain curves, breaking strength and elongation rate at break of PGA/PLA composite fiber membranes with different mass concentrations of PC

2.4 水接触角分析

水接触角是表征材料润湿性的常用方法。为了验证PC加入后对PGA/PLA复合纤维膜亲水性的影响，对加入不同质量浓度PC的复合纤维膜进行水接触角测试，结果如图4所示。

图4 PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜水接触角Fig.4 Water contact angle of PGA/PLA composite fiber membrane with different mass concentrations of PC

由图4可知，不添加PC的PGA/PLA为疏水纤维膜，水接触角大于130°且在30 s内比较稳定。0PC、2.5PC、5PC、10PC样品在1 s的水接触角分别为130.33°±1.46°、13.97°±1.31°、19.60°±0.95°、24.33°±0.70°，在30 s的接触角分别为130.80°±0.53°、0、8.23°±0.32°、11.73°±0.83°，由此可见加入PC后纤维膜由疏水变为亲水。随PC质量浓度增大，去离子水在纤维膜上的浸润速度减慢，说明PC质量浓度会影响去离子水在纤维膜上的浸润性，这可能是因为添加PC使得纤维直径增大，从而使纤维膜的孔径减小，导致去离子水更不容易渗入[23]。以上结果表明，PC的加入可以增加纤维膜的亲水性，这对抗细胞黏附有一定的积极作用。

2.5 降解性能

对所制备的复合纤维膜进行28 d降解性能评价，降解后剩余质量、剩余强度与降解时间的关系如图5所示，降解0、7、21、28 d的复合纤维膜SEM图如图6所示。所有降解样品均在28 d内保持原有形状且未解体。由图5(a)可知：随着PC质量浓度的增加，样品在28 d内的失重率增加；0PC样品失重最低，在PBS溶液中培养28 d后剩余质量分数为67.26%，失重主要源于PGA降解；10PC样品降解28 d后剩余质量分数为29.70%，质量损失主要源于PGA的降解和PC溶解。可以观察到7 d内添加PC的复合纤维膜质量快速下降，主要原因是PC从纤维膜表面溶解，说明在5～7 d的粘连形成关键时期PC持续存在，7～21 d降解速率比较稳定，21～28 d降解速率略有提高。由图5(b)可知：添加PC的复合纤维膜在降解后，强度损失会减小；PC加入越多，剩余强度百分数越大，这可能是因为加入PC后改善了PLA材料的脆性。10PC样品在降解21 d后的剩余强度百分数为73.99%，即断裂强度为3.25 MPa，证明降解21 d后10PC样品依然可以保持一定的力学性能。

图5 PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜体外降解剩余质量、剩余强度与降解时间的关系Fig.5 Relationships between residual mass, residual strength and degradation time of PGA/PLA composite fiber membranes with different mass concentrations of PC in vitro

由图6可知，0PC样品在降解21、28 d出现了较多纤维断裂，10PC样品未出现纤维断裂，但单根纤维变细。这可能是由于添加PC后复合纤维膜由疏水变为亲水，研究[21]表明疏水材料通常发生表面降解，亲水材料可以改善水的扩散，降解时水可以进入材料内部，从而发生本体降解。

图6 PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜降解0、7、21、28 d后的SEM图Fig.6 SEM images of PGA/PLA composite fiber membranes with different mass concentrations of PC after 0, 7, 21 and 28 days degradation

2.6 细胞黏附行为研究

研究[12]证明，静电纺纤维膜因独特的微纳孔结构，具有阻止成纤维细胞入侵和穿透的能力，但成纤维细胞仍可在纤维膜上黏附和增殖。将PC加入PGA/PLA复合纤维膜的最终目的是提高纤维膜亲水抗污性，从而抑制成纤维细胞的黏附，为了评价所制备的复合纤维膜是否有抗粘连应用潜力，采用CCK-8及荧光染色法对含有不同质量浓度PC的PGA/PLA复合纤维膜进行细胞黏附和增殖分析，测试结果如图7和8所示。

图7 L-929细胞在PGA/PLA与不同质量浓度PC复合的纤维膜上的吸光度及增殖率Fig.7 Absorbance and growth rate of L-929 cells in PGA/PLA composite fiber membranes with different mass concentrations of PC

图8 L-929细胞在样品表面黏附的荧光显微镜照片Fig.8 Fluorescence microscope images of L-929 cells adhering to the sample surface

由图7(a)可知，L-929成纤维细胞在每种纤维膜上的数量随时间延长而逐渐增加。经计算可知，培养1、3、5 d后0PC样品上的细胞数量分别为空白对照组(TCP)的95.59%、106.86%、98.44%，始终保持较高的细胞活力。在培养1、3、5 d后，L-929成纤维细胞在含有PC的复合纤维膜上的数量明显少于纯PGA/PLA纤维膜及空白对照组，且PC质量浓度越大则细胞数量越少。由图7(b)可知，空白对照组及0PC、2.5PC样品上的细胞数量随时间增加而增多，5PC、10PC样品上的细胞在第5 d增殖率有所下降，表明添加质量浓度为0.05 g/mL以上PC的样品对细胞增殖有较好的抑制作用。综上所述，添加PC的复合纤维膜可以有效抑制成纤维细胞在纤维膜上的黏附和增殖，且含PC越多则抗黏附效果越好。虽然10PC样品水接触角略大于5PC及2.5PC样品，但也具有良好的亲水性，仅由于纤维形貌影响了去离子水的浸润速度，细胞试验及防粘连膜植入人体时，纤维膜处在液体环境下已被完全浸润形成水化层，因此10PC样品的抗细胞黏附效果最好，可能是由于PC质量浓度增加使纤维膜表面的水化层效果增强。

从图8可以看出：L-929成纤维细胞在空白对照组及0PC样品上生长得较为密集，随培养时间的增加，黏附细胞增多；加入PC后对细胞增殖有一定的抑制作用，10PC样品黏附的细胞数量最少，具有良好的抗黏附效果，可以起到防黏附屏障作用。

3 结 论

(1)PGA/PLA与PC共混后进行静电纺丝，制备了纤维形貌良好的纳米纤维膜，纤维直径随PC质量浓度升高而增大，红外光谱证实PC已被成功负载在纤维膜中。

(2)通过在PGA/PLA纤维膜中添加PC，纤维膜由疏水转变为亲水，证实添加PC可显著改善纤维膜的亲水性。

(3)在PGA/PLA纤维膜中添加PC对纤维膜的力学性能影响较大，断裂强度和断裂伸长率均会降低，但纤维膜断裂强度随着PC质量浓度的增加而增大，且断裂强度最低的2.5PC纤维膜也有较好的力学性能。

(4)添加PC后纤维膜在28 d内质量损失较0PC纤维膜显著增大，但28 d内仍可保持原有形状且未解体，添加PC可改善PGA/PLA纤维膜降解后的力学性能。

(5)由细胞增殖及荧光染色试验表明，含PC的PGA/PLA纤维膜具有良好的抗L-929成纤维细胞增殖和黏附效果，其中10PC纤维膜的抗黏附效果最好。