2019—2021年日照市规模牛场结核病监测分析

李 英，韩 勇

1.山东省日照市五莲县叩官畜牧兽医站，山东 日照 262300；2.山东省日照市动物疫病预防控制中心，山东 日照 276800

牛结核病（bovine tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人畜共患病，在世界各国均有发生。在世界动物卫生组织的疫病名录中，牛结核病被列为B 类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛结核病的流行对养殖业及民众健康都会造成严重的危害[1]，威胁到畜产品质量安全和公共卫生安全。

2021 年8 月2 日，山东畜牧兽医局印发《山东省重点动物疫病监测净化工作方案（2021 版）》，要求推进全省重点动物疫病监测净化，提高规模养殖场管理水平和疫病防控能力，推动动物疫病防控从稳定控制到净化消灭转变。2021 年10 月7 日，农业农村部下发《关于推进动物疫病净化的意见》，要求推进动物疫病净化工作，力争通过5 年时间，在全国建立一批高水平的净化场。2022 年3 月，山东省印发《山东省动物疫病净化场评估技术规范》，要求推进牛结核病等疫病净化工作。

为做好牛结核病监测净化工作，2015 年以来，日照市动物疫病预防控制中心开展牛结核病净化关键技术研究，对牛结核检测方法进行研究。目前，牛场结核病的监测净化主要采用皮内变态反应，该方法虽然经典，但操作费时费力，结果判定受人为因素影响较大。目前，体外γ-干扰素的检测方法已被澳大利亚、新西兰和欧美等国家批准为正式试验方法，并且为OIE 推荐的方法[2]。本试验采用γ-干扰素ELISA 方法，对全市26 个牛场780 份样品进行检测，了解日照市牛场结核病的流行状况，旨在为净化牛结核病提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品及抽检方法

依托胶东半岛口蹄疫无疫区和山东省无疫省建设，在全市的牛场进行摸底调查，对全市的牛场建立抽样框。根据建立的抽样框，在抽样框中随机抽样。采用流行病学抽样方式，由于采用实验室检测要考虑检测方法的敏感性，即检测到阳性动物，按照中国动物卫生与流行病学中心设计Epi Sampling Calculator 软件，以估计流行率的抽样方法进行抽样监测，抽样样本量计算公式[3]为：

其中n为抽样个数，CL 为置信水平，D为群中的阳性动物数（等于群内个体数与预定流行率的乘积），N为群内个体数，Se 为检测方法的敏感性。

按照置信水平95%，预期流行率10%，每场每次采样不少于30 份。2019—2021 年，在日照市4 个区（县）分别采集26 个牛场样品进行试验。样品采集情况见表1。

表1 日照市牛场采样情况

1.2 检测试剂与仪器

牛结核γ-干扰素ELISA 试剂盒购自科前生物公司，生物安全柜购自新西兰公司，超纯水纯化系统（Cascada）由美国PALL 生产，移液器由Eppendorf 生产，5430R 冷冻高速离心机由 Eppendorf 公司生产，GO 酶标仪由Thermo 公司生产。

1.3 样品前处理

1）采血。无菌采集牛全血5 mL，肝素钠抗凝，室温条件下24 h 内送实验室进行刺激培养。培养试验开始前准备无菌清洁的2 mL 平底离心管和无菌PBS。

2）血液分装。分装前应将装有抗凝血的采血管上下轻轻颠倒5～10 次，充分混匀血液样本。将每份抗凝血加入3 个2 mL 离心管中，1 mL/管。

3）结核菌素工作液配制。按每个样本所需100 μL结核菌素工作液（临用前按无菌操作配制），将刺激抗原对照按无菌操作各取100 μL 依次加入3 支离心管中。盖严，轻轻摇动离心管，使血液与刺激抗原或PBS 充分混合，置37 ℃培养16～20 h，获得2 种抗原刺激的血液培养上清和PBS 血液培养上清，如果上清不足100 μL，可2 000 r/min 离心5 min。

4）样本贮存。如果不立即检测上述血液培养上清，可收集后低温保存，检测时先将样本恢复至室温。上清在2～8 ℃可保存7 d，在-20 ℃以下可保存3 个月。

1.4 检测方法

1）取出牛结核试剂盒抗原包被板，平衡至室温（根据样本多少，可拆开分次使用），按样本布局表加入刺激后的血液培养上清样本，100 μL/孔；同时，设阳性对照、阴性对照各2 孔（阴阳性对照不稀释），100 μL/孔，置37 ℃温育45 min。

2）甩掉板孔中的液体，每孔加入稀释好的洗涤液300 μL，无需静置，甩掉板孔中的洗涤液，重复洗涤共计3 次，最后1 次在吸水材料上拍干。

3）每孔加入兔抗牛r-干扰素多克隆抗体100 μL，置37 ℃温育30 min。

4）洗板3 次，每孔加入酶标记物 100 μL，置37 ℃温育30 min。

5）洗板5 次，每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，混匀，置室温（20～25 ℃）避光显色10 min。

6）每孔加入终止液50 μL，10 min 内在酶标仪上测定各孔D630nm值。

7）阳性对照D630nm平均值≥1.0，阴性对照D630nm平均值＜0.3 试验成立。判定标PD 血液培养上清孔D630nm值记作DbpD，PPD 血液培养上清孔D630nm值记作ODapp，PBS 血液培养上清孔D630nm值记作ODpbs，计算ODbppD、ODappd 及ODpbs 之间的差值。ODpp-ODpbs20.2 且ODbpD-ODappd≥0.2 判为牛结核病阳性，其他情形均判为牛结核病阴性。

2 结果与分析

2019-2021 年，对全市26 个牛场点开展监测，共检测样品780 份。其中，2019 年和2020 年抽检牛场各8 个，2021 年抽检牛场10 个，均未检测出阳性场和样品（表2）。

表2 2019—2021 年全市规模牛场结核检测情况

3 讨 论

1）采用流行病学调查抽样软件进行抽样，在抽样框中先对场群随机进行抽样，群体确定后再根据流行病学方式进行群内采样。由于采样科学，一定程度上能反映日照市牛结核的感染状况。

本试验应用流行病学调查抽样软件进行抽样，按照置信水平95%，预期流行率10%，每场每次采样不少于30 份，检测结果显示样品均为阴性，未发现日照市规模牛场结核病感染情况。对场群采样由于时间、物力等原因，采集场数量较少，仅采集了26个，不能最大限度地反映感染情况。另外，由于牛结核病阳性率较低，仅采样30 份，数量相对较少，下一步监测可加大采样数量，尽可能最大限度地反映牛群感染情况。

2）本试验采用γ-干扰素ELISA，要严格按照要求，采集牛全血，对于样品的前处理严格按照试剂盒说明书，采样后要在24 h 内送达实验室，实验室对收集后当天进行检测的标本，储存在4 ℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20 ℃或-70 ℃条件下保存，避免反复冻融。标本2～8 ℃可保存48 h，部分标本需添加抑肽酶。

3）准确诊断感染牛结核分枝杆菌的动物对牛结核病的控制和进化起至关重要的作用[4]。国内外牛结核病的检疫方法很多，目前临床上应用最广的是牛结核变态反应。然而很多学者认为反复检疫、重症结核病牛、体质低下等原因，均使变态反应不能检出结核病牛，而ELISA 方法能克服这一缺点[5-6]。γ-干扰素ELISA 检测方法比其他检测方法有更高的灵敏度和更快速的重复检测能力，研究表明，γ-干扰素ELISA 检测的敏感性范围为73%～100%，特异性范围为85.0%～99.6%[7]。本试验采用γ-干扰素ELISA检测方法，对全市26 个牛场进行监测，净化效果显著，说明该方法可靠，可进一步进行推广。

4）牛结核病是由结核分枝杆菌引起的一种重要的人畜共患病，威胁畜牧业的发展和人类的健康[8]。规模牛场是疫病净化的实施主体和实际受益者，应主动开展牛结核病等人畜共患病监测净化。规模牛场要按照国家制定的净化政策要求，加强防疫软硬件建设，加强生物安全防护水平，配齐相应的人力、物力、财力。结合本场实际，制定自场的净化方案，开展净化工作。要按照基线调查、监测净化的路线，采取检测、阳性奶牛淘汰清群、无害化处理等措施。要健全生物安全防护设施设备、加强饲养管理、严格消毒、规范无害化处理。养牛场优先从有《种畜禽生产经营许可证》的牛场引种，国外引进种牛和胚胎应符合相关规定，优先从获得农业农村部净化评估认证的牛场引种。对引进的牛只要做好抽检，由具备资质的第三方实验室出具检测报告。牛场所用精液和胚胎应进行检测，确认开展净化的特定病种为阴性。对引入牛只尤其应实行严格的隔离检测，一般在独立的隔离舍隔离40 d 以上，确保临床健康、净化病种感染阴性后，经彻底消毒方可进入生产区。

2015 年起，日照市动物疫病预防控制中心在全市大力开展规模牛场“两病”净化工作，制定适合的净化方案，对净化关键技术进行研究。经过多年的监测净化，全市多年未检测出牛结核阳性牛，防控成效显著。目前，全市已有2 家奶牛场通过省级结核净化场。下一步要继续加大监测净化力度，做好牛结核监测净化工作。