顺式-异戊烯基转移酶调控天然橡胶合成的研究进展

谢全亮，朱烨萌，马子璇，马璐瑶，杨起航，王厚德，李鸿彬

（石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832003）

天然橡胶（NR）是关系民生、医疗、航天和国防等领域的重要战略物资[1]。2017年，欧盟评估世界27种稀缺原材料中，NR是唯一的生物原料，这充分说明NR在稀缺资源中的重要地位[2]。全球90%以上的NR来源于巴西橡胶树，巴西橡胶树是极为重要的橡胶经济作物。因橡胶树的原植地破坏、叶枯病侵蚀以及人工采胶耗时耗力等原因，NR产量受到严重影响。根据天然橡胶生产国协会报道显示，2010，2014，2019和2020年全球NR消费量分别为1 000万、1 200万、1 155万和1 259万t[3]。我国已连续多年为全球NR消费量最高的国家[4]，而我国NR年产量不足年消费量的20%，远低于国际公认30%的安全产量保障线。我国NR基本依赖于进口，一旦阻断进口渠道，我国NR产业则难以持续发展。因此，提高NR产量和寻找NR替代经济作物是我国工农业生产发展和国防安全需求亟待解决的重要问题。

巴西橡胶树是唯一栽培种植生产NR的树木[5]。目前，每年因橡胶树病害和12%～50%的采收割胶死皮发生率，导致NR损失率高达40%左右[6]。

橡胶生物合成机制的精确解析是NR基础研究中的重要课题。橡胶生物合成的2种主要途径是甲羟戊酸（MVA）途径（在细胞质内进行）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP/DOXP）途径（在质体内进行），2种途径都可以合成类异戊二烯橡胶单体IPP（C5H8）[7]。然而，在其他产胶植物中也发现了顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶（如银菊橡胶和蒲公英橡胶）和反式-1，4-聚异戊二烯橡胶（如杜仲橡胶）[8-10]。由于反式-1，4-聚异戊二烯橡胶分子是硬质热塑性材料，可在低于60 ℃的温度下快速结晶，更适合作为高尔夫球套和假牙等的材料[11]。

B.L.ARCHER等[12]在1969年首次提出橡胶转移酶（RTase）是橡胶生物合成的主要合成酶，也是橡胶碳骨架生物合成的关键酶。RTase是一种顺式-异戊烯基转移酶（CPT），通过顺式构型进行附加IPP缩合，具有确定NR分子链长度的专门机制。2013年，巴西橡胶树基因组草图被首次报道[13]，揭示了橡胶生物合成不是RTase单一酶作用的结果，奠定了NR生物信息学研究基础。2016年，C.R.TANG等[14]对橡胶树基因组进一步测序，获得1.47 Gb基因组覆盖率为93.8%的结果。2020年，J.LIU等[15]利用Hi-C技术和单分子实时深度测序，将橡胶树基因组装配到18条染色体上，鉴定了许多与产胶相关的候选基因，发现部分基因与橡胶树栽培品种中的橡胶生物合成有关。

1 聚异戊二烯和NR的生物合成调控机制

聚异戊二烯与NR分子的基本碳骨架结构极为相似，因此二者存在相同的生物合成机制。聚异戊二烯生物合成途径可分为4阶段。第1阶段中2种IPP生物合成途径（MVA和MEP/DOXP途径）可在植物细胞中提供IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。MVA途径是由2个乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）分子缩合形成的乙酰乙酰辅酶A（acetoacetyl-CoA）引发，再通过Acetyl-CoA进一步缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA），HMG-CoA在胞质中进一步缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS），而HMGCoA在HMG-CoA还原酶作用下还原形成关键的中间分子MVA；随后MVA被磷酸化和脱羧得到IPP，所得IPP通过IPP异构酶（IDI）转化为DMAPP。而MEP/DOXP途径始于丙酮酸和3-磷酸-D-甘油醛的缩合，通过1-脱氧-木糖-5-磷酸合成酶（DXS）形成DXS，通过DXS还原异构酶转化为关键的中间MEP，再以（5～6）∶1的比例形成IPP和DMAPP的混合物[16]。

第2和第3阶段是通过异戊二烯链延长酶/CPT的作用，IPP与烯丙基二磷酸酯、DMAPP和低聚异戊二烯基二磷酸依次缩合形成线性类异戊二烯。实际上，有反式-异戊二烯基转移酶（tPT）和CPT 2种类型的转移酶，其在稠合的异戊二烯单元中新形成的双键的立体化学不同[17]。在第2阶段中，全部E-低聚异戊二烯基二磷酸、香叶基二磷酸（GPP，C10）、法呢基二磷酸（FPP，C15）和香叶基香叶基二磷酸（GGPP，C20）都是由1—3种IPP分子通过与特定的tPT结合，再与DMAPP作用最终形成。在第3阶段中，将全-E-短链异戊二烯基二磷酸酯用作底物，分别通过tPT或CPT构型进行附加IPP缩合。通常RTase严格识别烯丙基二磷酸酯底物的异戊二烯链长度，并严格调节缩合异戊二烯单元中双键产物的链长。由于难以确定异戊二烯单元的高相对分子质量聚合物末端基团的精确结构，因此橡胶生物合成途径中第4阶段所涉及的大多数机制仍然未知。

通过对多汁乳菇、向日葵和菊科植物等相对分子质量小的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶进行详细分子结构分析，发现了分配给伯醇和脂肪酸酯的低信号[18]，随后证明橡胶树的相对分子质量大的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶分子具有与相对分子质量小的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶分子相似的部分[19]。橡胶树的蛋白酶处理的NR的酯交换反应表明：NR分子可能将具有饱和或不饱和C10脂肪酸结合到C20链上，其中18∶0和18∶1的脂肪酸占主导地位[20]。上述证据与混合（Z，E）型聚异戊二烯的分子结构及其在高等植物中的酯化形式的整合显示[21]：NR分子的α末端（与异戊二烯单元相反的一端）含有ω末端化合物，具有伯醇或脂肪酸酯的一部分。因此，橡胶生物合成的第4阶段中可能是将第3阶段中形成超长链聚异戊二烯基焦磷酸盐至少部分去磷酸化并酯化，但是负责NR修饰的酶和确切机制仍然未知。

2 巴西橡胶树的橡胶生物合成调控机制

橡胶生物合成是将IPP作为合成原料，先经Acetyl-CoA的合成起始阶段，接着HMG-CoA经过转化形成MVA，而MVA转化成IPP，最后由多个IPP分子通过顺式聚合的方式形成高分子聚合物[22]。橡胶粒子（RPs）是橡胶生物合成和贮存的特殊细胞器，RPs膜上有许多种蛋白质共同调控橡胶生物合成[23]，主要通过调控RPs上蛋白质的表达和酶的活性来起作用。在RPs膜上最丰富的蛋白质是IPP、CPT、小橡胶粒子蛋白质（SRPP）和橡胶伸长因子（REF）[24]，其中CPT占比较大，不仅影响橡胶生物合成的速度，还直接关系着胶乳的产量[25]。CPT、SRPP、REF和桥链蛋白（HRBP）等的合成与内质网（ER）紧密相关，质膜上的CPT是被SRPP转入到ER内，而HRBP与CPT结合并相互作用后，再将CPT重新转至质膜中[26]。虽然这些蛋白质在橡胶生物合成中起着积极和关键作用，但NR相对分子质量大小的决定性因素仍不清楚。

橡胶树割胶后外施乙烯、茉莉酸或者通过多次割胶刺激产胶，从而使流胶时间延长，达到增产的目的。割胶刺激会使CPT，SRPP和REF的信使核糖核酸（RNA）在乳管层和胶乳中的表达量很高[27]。SRPP同源物在乙烯的刺激下参与橡胶生物合成，与REF不同，其只能在产生相对分子质量大的橡胶的植物（如巴西橡胶树和银胶菊）中被发现，而不能在产生相对分子质量小的橡胶的植物（如无花果和孟加拉榕）中被发现，这也从侧面说明了SRPP在橡胶合成延伸中更为重要。但RPs定量蛋白质组学最新研究表明：RPs膜及结合物几乎包含橡胶生物合成途径中所有的蛋白酶和辅助因子以及IPP前体等，RPs上至少含有或者结合有几百种蛋白质及其复合物。复合物调控并不在基因水平，而在蛋白质，特别是蛋白质翻译后修饰水平，这些蛋白质包括CPT（RTase）、HMGCoA、SRPP和REF等几种重要蛋白质或酶的不同异构体，其中REF可能通过其结构域和其他REF或SRPP进行聚合，再通过转移酶F-ATPase的β-亚基和其它亚基聚合，形成复杂的蛋白质复合物，共同执行橡胶生物合成的相关功能[28]。乙烯刺激橡胶树增产的机制很可能是RPs上的蛋白质复合物启动关键调控开关，但相关功能研究还需组学分析以及在产胶植物中的进一步转基因验证。

3 CPT是橡胶生物合成中的关键酶

3.1 CPT可通过多条途径影响橡胶生物合成过程

CPT又称为橡胶转移酶（HRT），是NR生物合成中的关键酶[22]，其家族成员可分别与法呢基焦磷酸（FPP）、SRPP、HRBP和REF等互相作用，调控这些关键蛋白的活性，从而在橡胶生物合成过程中起到重要的调控作用。橡胶树RPs蛋白质分离的初步研究发现：经乙烯和机械伤害等刺激后，CPT发生蛋白质翻译后修饰，从而激活一系列生物学反应，这很可能是RPs膜上的蛋白质复合物启动关键调控开关，使单分子IPP聚合形成长链聚合物[29]。在短角蒲公英（TB）RPs上的短角蒲公英顺式-1，4-聚异戊二烯转移酶（TbCPT）蛋白质与SRPP共定位的结果为橡胶生物合成和应激反应之间的联系提供了进一步证据[30]。

TB胶乳中共鉴定到3个CPT基因，而其他含有顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的植物胶乳中有CPT同系物，如蒲公英、莴苣和大戟属等植物中的CPT已被分离并重组，重组蛋白质在体外没有显示出CPT活性[31]，其中的作用机制尚不清楚。但RNA干扰TB乳胶中CPT表达结果显示[32]：胶乳含量明显降低，橡胶转移酶活化子（TbRTA）可结合RPs表面的CPT形成复合体，提高TbRTA活性；RNA干扰抑制TbCPT和TbRTA基因的表达，均可抑制橡胶生物合成过程，这都表明CPT参与了NR的形成。

橡胶树橡胶转移酶1（HRT1）、橡胶树橡胶转移酶2（HRT2）和橡胶树橡胶转移酶1-2（HRT1-2）是CPT的家族成员。据报道[33]，HRT1是来自橡胶树HbCPT，HRT1和HRT2的重组蛋白质，在体外是不会表现出CPT独特的活性。在体外并当引入洗涤剂洗脱的橡胶粒子（WRP）时，HRT1才能显示出明显的RTase活性，并且HRT1-2主要在胶乳中表达。RTases具有多种组分构成，其中一些是膜的组分，另一些是与WRP膜蛋白质的非共价强烈相互作用相关联的组分，经预测可能是橡胶生物合成蛋白质对应的底物以及活化剂的复杂性阻止了RTases复合物的完全重构，从而抑制了RTases的活性[34]。WRP蛋白质组学和蛋白质相互作用网络分析揭示了HRT1，REF以及HRT1-REF连接蛋白质组成了蛋白质复合物，从WRP上组装的该蛋白质复合物观察到RTases的活性增强，表明含有HRT1的复合物为橡胶生物合成机制起到重要的调控作用。

3.2 CPT是NR生物合成中的关键酶

RTases是唯一能够形成CPT家族的独特亚组，RTases对IPP底物具有较强的亲和力，可防止橡胶生物合成过程中IPP的短缺，只有在IPP超过细胞代谢需求时才能产生长分子链聚合物[35]。在非产胶植物中，CPT与RTase易被混淆，除去RPs上35 kDa的CPT后，RTase的活性并不会产生影响。因此，CPT可以影响橡胶生物合成，而不影响RTase的活性。CPT还参与甾醇合成，从而形成细胞膜（可能包括RPs膜）。此外，大多数长分子链CPT的直接产物是相对短分子链的顺式-烯丙基焦磷酸盐，其可作为橡胶生物合成的引发剂。

不同类型CPT蛋白质的定位是不同的，具有不同的底物结合位点，从而产生不同的聚合产物，CPT家族成员具体定位及功能必须解析清楚，这是研究CPT在NR生物合成中具体作用的前提。

自20世纪80年代R.THOMAS提出基因组学概念后，以基因组学为核心的转录组学、蛋白质组学以及代谢组学、等组学相继展开。生物信息学与多组学技术结合已经成为生命科学、医学以及系统生物学研究的重要研究手段。产胶经济作物巴西橡胶树[36]和蒲公英属已相继开展了组学研究。在转录组研究方面，F.PANARA等[37]在低含胶量（LR）和高含胶量（HR）的俄罗斯蒲公英（TKS）中进行转录组比较显示，LR TKS和HR TKS参与顺式-1，4-聚异戊二烯生物合成的基因高度表达，并证明了倍半萜类化合物、苯丙烷类以及次级代谢单萜类化合物生物合成的基因在LR TKS中上调。用茉莉酸甲酯（JA）处理TKS幼苗根后进行转录组差异表达分析[38-39]，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）、法呢基焦磷酸合酶（FPPS），IDI，GGPP和REF/SRPP的表达增加，但这些关键基因在转基因功能验证方面并未进一步阐明。JA可以调节TKS根中的次生代谢途径，参与橡胶生物合成的几种候选基因的表达增加，JA响应的转录因子与基因间相互作用，这些基因蛋白质组学层面的研究现在还不深入。Z.LUO等[40]基于LR TKS和HR TKS根转录组相关的单核苷酸多态性（SNP），确定了合适的脱氧核糖核酸（DNA）标记，可以在TKS生长发育早期确定橡胶产量。转录组学虽然在TKS研究中逐渐展开并取得了突破性进展，但单组学研究不能够全面解析TKS橡胶生物合成调控机制，还需利用多组学及转基因等手段深入研究橡胶生物合成的机制。

在蛋白质组研究方面，2012年D.WAHLER等[41]通过双向电泳（2-DE）分离TB的胶乳全蛋白，首次报道TB胶乳的凝胶图谱，共鉴定了278个独特的蛋白质点。结果显示，TB胶乳蛋白质中参与脂质代谢和运输的蛋白质较多，而参与应激反应的蛋白质相对较少。2019年，Q.L.XIE等[42]对TKS成熟根全蛋白质的研究显示：由2-DE和鸟枪法（shotgun）分别鉴定231和3 545种蛋白质发现，TKS的CPT基因启动子具有乙烯响应元件，这也是乙烯能促进TKS产胶的根本依据。结合蛋白质组学的2种方法分析TKS成熟根的全蛋白质得出：橡胶生物合成的2种途径中所包含的所有蛋白质几乎得到鉴定，但每种蛋白质的家族成员鉴定还不够全面，有些蛋白质在TKS成熟期时并未表达，还需要进一步通过外界刺激让其表达产生作用。

4 利用TKS研究橡胶生物合成的必要性

TKS是菊科，主要分布于我国新疆、哈萨克斯坦及欧洲。其根部含有大量以顺式-1，4-聚异戊二烯为主的橡胶，其橡胶的分子结构和性能与NR极为相似，由于生育期短、组织培养简单、遗传转化容易，已成为研究产胶机理的模式植物[43]，同时由于其适应性强、分布范围广、机械化采收便利等，被认为是最有商业化前景的NR替代资源植物。但TKS在很大程度上未被驯化，存在一些固有问题，尤其是其橡胶生物合成能力未达到规模化种植要求，制约了产业发展。解析TKS橡胶生物合成机理是快速提高TKS橡胶产量的重要途径之一。前期蛋白组学研究发现，TKS的MVA和MEP途径中所有蛋白质都参与橡胶合成，TKS基因组中鉴定了8种CPT和2种编码RPs蛋白质基因CPTL，并且其家族成员CPTL1在乳胶中高度表达，这些家族成员为后续CPT基因的具体功能研究提供了更多靶标基因[42]，但调控橡胶生物合成的关键基因/蛋白质还未精确解析。深入研究TKS中CPT在橡胶合成调控复合物的组成及不同组成部件的具体生物学功能，很可能为揭示橡胶生物合成和调控的精准机制提供新的研究思路。

5 TKS是补充或替代NR的新型产胶植物

TKS是二倍体多年生草本植物，根部橡胶质量分数可达约0.24，其产胶周期短、生长适应性强、具有较高成活率和大规模栽培的能力[43-44]。然而，TKS具有与其他蒲公英属高杂合性、自交不亲和性以及橡胶含量未达到商业上规模化种植要求等特性[45]。TKS高杂合性对于产生完整的基因组序列和以其作为产胶经济作物提出了严峻的挑战。

从TKS中已克隆了控制橡胶生物链延长及合成的基因，并且对其功能进行了初步分析[46-48]，但研究仅局限于其橡胶生物合成的代谢途径等方面。

基于TKS基因组的公布[48]，转录组学和蛋白质组学方面的研究[49]也不断深入。利用TKS基因组深入分析数据，发现一些与自交衰退相关的可能候选区域，证实了TKS自交不亲和性的遗传物质基础。TKS基因组成功解析大大降低了克隆橡胶生物合成的关键基因的难度，加速推进基于基因组信息的TKS农艺性状关联分析，从而提升通过转基因技术和基因编辑技术提高TKS分子育种的能力，也加速TKS中橡胶生物合成的分子机制研究和遗传改良优质品种的进程。

6 结语

目前橡胶生物合成和调控很可能主要是在RPs膜上进行的，通过促进RPs膜上蛋白质复合物中重要蛋白质的磷酸化、泛素化和糖基化等翻译后修饰来精准调控橡胶的生物合成。然而，调控CPT家族关键成员与上下游相关蛋白质以及橡胶生物合成的具体调控机制还不清楚。未来应主要开展产胶植物CPT的关键家族成员的研究，以及利用植物激素等刺激产胶植物寻找CPT在橡胶生物合成中的规律。通过基因组学、转录组学和蛋白质组学相结合，找到橡胶生物合成的关键RNA和蛋白质，确定蛋白质翻译后修饰调控方式，挖掘和筛选橡胶生物合成的关键基因/蛋白质，同时结合基因编辑和转基因技术，精确解析橡胶生物合成的关键代谢途径和关键基因/蛋白质，获得较为重要的原创性发现，为今后优质TKS的分子育种提供理论依据和基因资源，以及为NR产业多元化升级提供技术支持和理论依据。