子痫前期患者外周血及胎盘组织中Amphiregulin表达水平及与妊娠结局关系

刘红梅 刘晓玲 潘明霞 钟 丽

青岛妇女儿童医院(266000)

子痫前期是妊娠期高血压疾病的一种形式[1]，影响3%～7%的妊娠结局，可导致母婴死亡[2]。其确切病因尚不明确，遗传易感性、炎症反应、胎盘缺血缺氧以及血管内皮损伤已被报告为相关因素[3]。表皮生长因子(EGF)是参与正常细胞生长和分化的促有丝分裂蛋白，表皮双调蛋白(Amphiregulin)结合EGF样生长因子，是EGF配体[4]。Amphiregulin是胎盘、卵巢、睾丸、心脏、胰腺、脾脏、骨髓、血液、肾、肺、结肠和乳腺等众多器官和组织中分泌的EGF配体[5]。Amphiregulin通过结合EGFR激活多种信号级联反应，参与细胞存活、增殖等生理过程[6]。据报道，在炎症和肿瘤条件下Amphiregulin表达量减少[7]。目前，尚未见Amphiregulin在子痫前期中的相关研究报道，因此本研究探讨子痫前期患者外周血和胎盘组织中Amphiregulin表达水平及与妊娠结局的关系，为子痫前期的诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年6月-2020年9月本院收治的子痫前期孕妇203例，根据病情分为子痫前期轻度102例、重度101例。纳入标准：①符合子痫前期诊断标准[8]；②单胎妊娠，剖宫产分娩；③患者及家属知情同意。排除标准：①内分泌疾病；②年龄18～45岁；③原发性高血压。同期产前检查健康孕妇108例为对照组。子痫前期重度诊断标准：在没有蛋白尿情况下，存在以下任何一种情况，即重度高血压(未服用降压药情况下休息后，收缩压160mmHg或舒张压≥110mmHg)、血小板减少症(血小板计数<100000/ml)、肝功能受损(肝转氨酶增加两倍)、肾功能不全(血清肌酐升高>1.1mg/dl或加倍在没有其他肾脏疾病的情况下血清肌酐升高)、肺水肿、新发脑或视力障碍。本研究遵循赫尔辛基宣言的原则，获得机构伦理委员会的批准，参与者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1胎盘收集剖宫产中获取胎盘，除去胎盘厚度的立方体部分(3.0cm×3.0cm)，收集从基底到胎盘内部区域的绒毛膜表面,磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤去除表面血液，将样品在液氮中速冻，-80°C保存。

1.2.2AmphiregulinmRNA检测采用实时荧光逆转录法(RT-PCR)。使用 UNlQ-10 Column TRIzol总RNA分离试剂盒(Sangon Biotech Co.Ltd.)分离胎盘、血清组织总RNA，使用 PrimeScriptTMRT 试剂盒(Takara Bio, Inc)逆转录为 cDNA。使用条件：30s 95℃，5 s 95℃、34 s 60℃、15 s 95℃和1min 50℃的50个循环。Amphiregulin基因特异性引物从PrimerBank获得，引物序列：Amphiregulin正向，5'-TCGATCGATCGATCGATCGGGGCTAG CTAGCTAGCTAGCTA GTCG-3'和反向，5'-TGGCGATCGATCGATCGATCGATCGTAGCTAG CTAGCTAGCTAGCC-3'。β-actin为内参基因，引物序列为正向，5'-TCGGGCCTAGCTAGCT AGCTAGCTAGGGCTAGCTAGCTGATCGTGT GC-3'，反向，5'-TGGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTA GTCGATCG-3'，使用2-ΔΔCq方法计算差异表达。数据表示为3个独立实验的平均值±标准差。

1.2.3Amphiregulin蛋白水平酶联免疫吸附法测定(ELISA)。Amphiregulin(Shanghai Sunred Biological Technology)。在MK-3 Multiskan FC酶标仪(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)450nm波长下测定样品吸光度(ng/ml)。Amphiregulin试剂盒测定内方差系数(CV)、测定间CV、检测范围和灵敏度分别报告为<10%、<12%和0.08～24ng/ml和0.076ng/ml。

1.2.4Amphiregulin蛋白免疫组化测定在4μm厚的石蜡包埋的前列腺组织切片上进行Amphiregulin(1:200，610153，BD Biosciences，San Jose，CA，USA)蛋白免疫组化测定。组织切片均行微波抗原修复预处理，使用Dako REALTMEnVision试剂盒(Dako, Carpinteria, CA, USA)检测。3-氨基-9-乙基咔唑(Immunotech，Foster City，CA，USA)用作色原并用Mayer's苏木精(Dako)复染。阴性对照染色在不应用一抗的情况下进行。Amphiregulin核表达通过评估染色强度≥10%的细胞中阳性情况下评分：0，无染色或≤10%阳性；1，弱染色；2，中度染色；3，染色性强，1～3为阳性表达。

1.3 妊娠结局评估

记录子痫前期患者产后结局，包括胎盘重量、新生儿出生体重及1min Apgar评分。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般情况比较

表1可见，病例组舒张压和收缩压均高于对照组(P<0.05)，两组年龄、体质指数(BMI)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等无差异(P>0.05)。

表1 两组一般情况比较

2.2 各组血清、胎盘Amphiregulin表达比较

血清及胎盘Amphiregulin mRNA、Amphiregulin 蛋白表达水平子痫前期重度组、子痫前期轻度组、对照组均依次升高(均P<0.05)。见表2。

表2 各组不同标本中Amphiregulin表达比较

2.3 Amphiregulin免疫组化阳性率比较

Amphiregulin主要定于细胞膜和细胞质，呈黄色或深棕黄色颗粒，Amphiregulin阳性为细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒；Amphiregulin阳性率子痫前期重度组、子痫前期轻度组、对照组逐渐升高(P<0.05)。见表3、图1(1938页)。

表3 各组Amphiregulin免疫组化阳性率比较[例(%)]

2.4 子痫前期严重程度与Amphiregulin表达相关性

子痫前期严重程度与胎盘及血清Amphiregulin mRNA、蛋白表达水平均呈负相关(r=-0.674、-0.601、-0.596、-0.587，P=0.001、0.015、0.004、0.009)。

2.5 各组孕产妇妊娠结局比较

胎盘重量、新生儿出生体重、1min Apgar评分在子痫前期重度组、子痫前期轻度组、对照组依次升高(均P<0.05)。见表4。

表4 各组妊娠结局比较

2.6 孕产妇Amphiregulin与妊娠结局相关性

表5可见，血清、胎盘Amphiregulin mRNA及蛋白与胎盘重量、新生儿出生体重、1min Apgar评分呈正相关(P<0.05)。

表5 孕产妇Amphiregulin表达水平与妊娠结局相关性

3 讨论

研究表明Amphiregulin相关基因和蛋白质在癌症和心血管疾病的发病机制中起着关键作用。该途径的核心是在肿瘤抑制因子处启动的激酶级联反应Hippo对其下游效应器，即癌蛋白Amphiregulin/TAZ。与非妊娠子宫内膜的子宫内膜基质细胞(ESC)相比，妊娠蜕膜细胞中Amphiregulin的表达更高。低Amphiregulin水平通过调节CDX2来调节滋养细胞侵袭和凋亡，从而促进子痫前期的发展[9]。因此Amphiregulin可能在子痫前期的病理生理学中起关键作用。

研究表明，Amphiregulin在人类妊娠期间由合体滋养细胞表达，并刺激人绒毛膜促性腺激素分泌。在嗜铬细胞瘤、产生皮质醇的肾上腺皮质腺瘤、神经节神经母细胞瘤和神经母细胞瘤的肿瘤组织中均有Amphiregulin mRNA表达。Amphiregulin对肾上腺分泌醛固酮、皮质醇和儿茶酚胺有刺激作用，导致血压升高[10]；Amphiregulin通过与EGFR结合促进细胞滋养层细胞的生长；通过自分泌或旁分泌途径激活细胞存活的信号级联导致子痫前期中胎盘床和绒毛外滋养层细胞凋亡增加[11]；Amphiregulin通过激活EGF/EGFR/SOS1通路抑制p53凋亡刺激蛋白，导致肝癌细胞的凋亡抵抗[12-13]。因此，Amphiregulin水平降低会导致细胞凋亡增加，由于滋养细胞增殖和存活的减少以及细胞凋亡的增加，Amphiregulin的减少可能在子痫前期的发病机制中起作用[13-14]。EGF-Amphiregulin复合物可能具有双重作用，即早期滋养细胞增殖和晚期滋养细胞分化，从而有助于控制胎盘生长[15]。国外研究报道与非子痫前期患者相比，子痫前期患者的血浆Amphiregulin水平降低，子痫前期妊娠胎盘滋养层细胞中EGF-Amphiregulin信号系统的广泛下调，提出假设，即子痫前期中EGF-Amphiregulin信号系统的缺陷导致绒毛外滋养细胞分化不当和细胞凋亡增加[16-17]。与该研究类似，本研究发现，与对照相比，子痫前期患者的血清及胎盘Amphiregulin mRNA和蛋白表达均降低，且随着子痫前期严重程度增加表达降低，子痫前期严重程度与胎盘及血清Amphiregulin mRNA和蛋白表达均负相关，说明子痫前期患者外周血和胎盘组织中Amphiregulin表达异常降低，且与子痫前期病情发展有关。

本研究分析了Amphiregulin表达水平与妊娠结局相关性，结果显示血清及胎盘Amphiregulin mRNA和蛋白表达水平均与胎盘重量、新生儿出生体和1min Apgar评分呈正相关。近期一项国外研究表明，Amphiregulin水平临界值3590pg/ml时，诊断重度先兆子痫的敏感性为67.9%、特异性为63.3%[18]。结合本研究中Amphiregulin表达与妊娠结局相关性明显，提示临床Amphiregulin可作为评估子痫前期患者妊娠不良结局的敏感生物学标志物。

综上所述，子痫前期患者外周血和胎盘组织中Amphiregulin表达水平异常降低，且与子痫前期严重程度相关；Amphiregulin表达水平与妊娠结局相关性明显，提示Amphiregulin可作为评估子痫前期患者妊娠不良结局的生物学标志物。