高光胁迫下香果树叶片生理生化指标变化及相关基因差异表达和功能分析

宋丽莉， 吴 琼， 吉喜燕， 罗瑞莉， 刘文娜， 赵华强， 侯梅芳

(上海应用技术大学生态技术与工程学院， 上海 201418)

光是植物进行光合作用的能量来源，也是调节植物生长发育和形态建成的重要环境信号，还是影响植物生长、存活和分布的重要生态因子[1]。但是，当植物吸收的光能超过其光合作用所需能量时，过剩的光能会引起活性氧积累，导致光系统受到损伤，光合水平下降，植物生长发育受阻[2]。

香果树(EmmenopteryshenryiOliv.)系茜草科(Rubiaceae)香果树属(EmmenopterysOliv.)惟一种，是中国特有的单种属植物，也是茜草科植物系统发育进化、形态演替及中国植物地理区系研究的重要材料[3]。此外，香果树还具有很高的观赏、药用和材用价值。然而，野生香果树种群正在不断衰退，分布区域逐渐缩小[4]，早在1991年就被《中国植物红皮书》[5]列为稀有种，并在《国家重点保护野生植物名录》[6]中被列为国家二级重点保护野生植物。自然状态下，香果树的种子萌发及幼苗生长状况直接影响其种群个体数量[7]。研究发现，光照强度过高会导致香果树的种子萌发率显著下降；而且，香果树幼苗的需光性随着植株发育阶段而改变，随着苗龄增长由喜阴逐渐转为喜光[8]。大田实验表明：香果树1年生幼苗在全光照条件下生长缓慢，并出现掉叶现象甚至死亡[9]；2年生香果树幼苗虽然能够基本适应全光照环境，但适度遮光更有利于其生长[10]。比较而言，林窗中的香果树幼苗生长最快，生物量最大，更适宜香果树幼苗生存；而林缘(光照强度过大)和林冠(光照强度过弱)中的香果树幼苗生长缓慢，成活率低[3,8,11]。因此，探究香果树的高光适应机制对于揭示其濒危机制具有重要价值，对于香果树合理保育措施的制订及种群恢复也具有重要意义。

研究发现，高光胁迫可导致香果树叶片的净光合速率、PSⅡ活性、最大光化学效率、实际光化学效率、非光化学猝灭系数、光化学猝灭系数、调节性能量耗散和相对电子传递速率等叶绿素荧光参数显著降低，而非调节性能量耗散则显著升高[12]。为了探明香果树应对高光胁迫的分子机制，笔者对对照和高光胁迫(光照强度分别为54和180 μmol·m-2·s-1)下香果树幼苗叶片的净光合速率、光合作用相关酶活性、抗氧化酶活性、激素水平、次生代谢物含量进行比较，利用RNA-seq技术对高光胁迫下香果树幼苗的转录组进行测序分析，对差异表达基因进行GO功能分析和KEGG代谢通路分析，对光合作用、花青素代谢、抗氧化酶以及脱落酸(ABA)代谢和信号通路相关基因的表达水平进行分析，并采用qRT-PCR技术验证转录组测序结果的可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

将香果树组培苗种植于装有V(草炭)∶V(珍珠岩)=2.5∶1.0混合基质的花盆(上口边长10.0 cm、下口边长7.0 cm、高度8.5 cm)中，置于DRXM-508光照培养箱(宁波江南仪器厂)中培养，培养条件为光照强度54 μmol·m-2·s-1、光照时间12 h·d-1、温度25 ℃、空气相对湿度70%，每7 d浇1次水。在上述条件下培养至幼苗长出6枚叶时，选取株高约15 cm、生长状态较为一致的植株进行高光胁迫实验。

1.2 方法

1.2.1 高光胁迫处理 将供试香果树组培苗分为2组，每组12株，在其他培养条件不变的情况下，一组继续置于光照强度54 μmol·m-2·s-1条件下培养，即对照组；另一组则置于光照强度180 μmol·m-2·s-1条件下培养，即高光胁迫组。培养48 h后，采样并进行相关指标测定分析。

1.2.2 生理生化指标测定 每组随机选取3株植株，采用LI-6400XT便携式光合作用测定仪(美国LI-COR公司)测定植株中部的1对对生叶的净光合速率，测定时，叶室光源采用红蓝光源，叶室内气流速率为500 μmol·s-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1。

净光合速率测定结束后，采集植株中部的1对对生叶，混匀后取样测定各生理生化指标，每个指标重复取样检测3次。参照Hao等[12]的方法测定叶片的叶绿素和花青素含量；参照Song等[13]的方法测定叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性；采用核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，产品编号BC0440)测定叶片的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性；参照陈霞等[14]的方法测定ABA含量。

1.2.3 差异表达基因筛选及功能分析 每组随机选取6株植株，分别取植株中部的1对对生叶，即为6个生物学重复，经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱中保存，用于转录组测序。转录组测序工作由上海中科新生命生物科技有限公司完成。采用Trizol(美国Invitrogen公司)提取叶片总RNA，样品检测合格后用于cDNA文库的构建，使用Illumina HiSeq平台(美国Illumina公司)将构建的cDNA文库进行测序。对测序得到的原始数据进行去除低质量序列、接头污染及N比例大于5%的reads等处理，得到高质量的有效测序数据(clean reads)；使用Trinity软件(https:∥trinityrnaseq.sourceforge.net/)对clean reads 进行denovo组装，获得unigenes；使用DESeq2软件[15]进行基因差异表达分析，差异显著性标准为︱log2FC︱>1、P-adjust<0.05，其中，FC为差异倍数(fold change)；对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析。

1.2.4 差异表达基因的qRT-PCR验证 采用与转录组测序相同的植物材料，随机选择8个差异表达基因进行qRT-PCR分析，验证转录组测序分析结果的可靠性。使用Primer Premier 5.0软件，根据预测基因的CDS序列设计荧光定量特异性引物，以香果树GAPDH基因(TRINITY_DN54866_c2_g1)作为内参基因，候选基因的引物序列见表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Thermo Fisher QuantStudioTM1 Plus荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行qRT-PCR扩增。扩增体系总体积20.0 μL，包括SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.4 μL、cDNA模板2.0 μL，用ddH2O将扩增体系体积补足至20.0 μL。

表1 用于香果树差异表达基因qRT-PCR验证的引物序列

扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s，共45个循环。采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，并换算成log2FC，以便与RNA-seq检测分析结果进行比较。

1.3 数据处理及统计分析

使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)和Duncan’s新复极差法进行方差分析和多重比较。

2 结果和分析

2.1 高光胁迫下香果树叶片生理生化指标的变化

检测结果(表2)表明：与对照(光照强度54 μmol·m-2·s-1)相比，高光胁迫(光照强度180 μmol·m-2·s-1)下香果树叶片的净光合速率、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性和叶绿素含量均显著下降，降幅分别为48.44%、26.69%和35.71%；花青素含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、抗坏血酸过氧化物酶活性和脱落酸含量显著升高，增幅分别为56.25%、10.14%、52.66%、35.57%、34.06%和1 116.46%。

2.2 高光胁迫下香果树差异表达基因筛选及功能分析

2.2.1 差异表达基因筛选 统计结果表明：与对照(光照强度54 μmol·m-2·s-1)相比(光照强度180 μmol·m-2·s-1)，高光胁迫下香果树含有6 776个差异表达基因，其中，上调差异表达基因有3 063个，下调差异表达基因有3 713个。

表2 高光胁迫下香果树叶片生理生化指标的变化1)

2.2.2 GO功能富集分析 上调差异表达基因的GO功能富集分析结果显示：上述上调差异表达基因富集到的GO功能条目共有2 022个，其中显著富集的GO功能条目有196个，分为生物过程(97个)、分子功能(70个)和细胞组分(29个)3类。各类型中富集程度排名前10的GO功能条目见表3。由表3可见：在生物过程中，富集到氧化还原过程的上调差异表达基因最多(155个)；在分子功能中，被富集到氧化还原酶活性的上调差异表达基因最多(196个)，富集到裂解酶活性的上调差异表达基因较多(48个)；在细胞组分中，富集到细胞质、细胞质部分、质体和叶绿体的上调差异表达基因均较多，分别有352、299、206和179个，且富集到其余条目的上调差异表达基因均超过30个。

下调差异表达基因的GO功能富集分析结果显示：上述下调差异表达基因富集到的GO功能条目共有1 835个，其中显著富集的GO功能条目有129个，分为生物过程(76个)、分子功能(39个)和细胞组分(14个)3类。各类型中富集程度排名前10的GO功能条目见表4。由表4可见：在生物过程中，富集到磷酸化、核酸模板转录、RNA生物合成过程、DNA模板转录及蛋白质磷酸化的下调差异表达基因均超过150个，富集到其余条目的下调差异表达基因有115～117个；在分子功能中，富集到转移酶活性、转移酶活性(转移含磷基团)、催化活性(作用于蛋白质)、激酶活性、磷酸转移酶活性(以醇基为受体)、蛋白激酶活性及DNA结合的下调差异表达基因均超过150个，富集到其余条目的下调差异表达基因有69～95个；在细胞组分中，富集到膜的下调差异表达基因最多(718个)，富集到MCM复合物的下调差异表达基因相对最少(仅4个)，被富集到其余条目的下调差异表达基因有19～30个。

表3 高光胁迫下香果树上调差异表达基因的GO功能富集分析1)

表4 高光胁迫下香果树下调差异表达基因的GO功能富集分析1)

2.2.3 KEGG代谢通路富集分析 差异表达基因的KEGG代谢通路富集分析结果(表5)表明：上述上调差异表达基因显著富集到15条代谢通路中，共包含353个上调差异表达基因。其中，富集到代谢途径的上调差异表达基因最多(122个)，富集到次生代谢物生物合成的上调差异表达基因次之(83个)，富集到抗生素生物合成、光合作用、碳代谢、长寿调解途径-蠕虫、类黄酮生物合成及卟啉和叶绿素代谢的上调差异表达基因有10～29个，而富集到光合生物的碳固定、类胡萝卜素生物合成、苯丙氨酸代谢及硫胺代谢等7个代谢通路的上调差异表达基因较少(均低于10个)。

由表5还可见：上述下调差异表达基因仅显著富集到5条代谢通路中，共包含86个差异表达基因。其中，富集到植物-病原体相互作用、植物激素信号转导和MAPK信号途径-植物的下调差异表达基因相对较多，分别有29、28和18个，富集到间隙连接和油菜素甾醇生物合成的下调差异表达基因较少，分别只有7和4个。

2.3 高光胁迫下香果树差异表达基因的表达分析

2.3.1 光合作用相关差异表达基因分析 高光胁迫下香果树光合作用相关差异表达基因分析结果(表6)显示：编码光系统Ⅰ中捕光复合物(LHCⅠ)的基因lhca4以及编码光系统Ⅰ中反应中心蛋白的基因psaA、psaE、psaG、psaH、psaK、psaL和psaO的表达水平均显著下降；编码光系统Ⅱ中捕光复合物(LHCⅡ)的基因lhcb1、lhcb2和lhcb5以及编码光系统Ⅱ中相关蛋白的基因psbC、psbK、psbO、psbP、psbQ、psbR和psbW的表达水平均显著下降。此外，编码细胞色素b6f复合物的基因petA、petC和petG，编码光合电子传递链成员质体蓝素的基因petE，编码ATP合成酶的基因atpC1和atpI的表达水平均显著下降；编码核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大、小亚基的基因rbcL和RBCS以及编码核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RCA的表达水平显著下降；编码叶绿素合成关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和原叶绿素酸酯氧化还原酶A的基因HEMA1和PORA的表达水平也显著下降。仅编码光系统Ⅱ中22 ku蛋白的psbS基因以及编码ATP合成酶α亚基的atpA基因和ATP合成酶δ链的atpD基因的表达水平显著上升。

表5 高光胁迫下香果树差异表达基因的KEGG代谢通路富集分析

表6 高光胁迫下香果树光合作用相关差异表达基因分析

续表6 Table 6(Continued)

2.3.2 花青素合成相关差异表达基因分析 高光胁迫下香果树花青素合成相关差异表达基因分析结果(表7)显示：编码花青素合成关键酶的基因PAL、CHS、F3H、UFGT6和UFGT3的表达水平均显著上升，同时，编码花青素合成转录因子的基因MYB6、MYB7、MYB8、MYB12、MYB36、MYB111、MYB113和GL3的表达水平也显著上升。

表7 高光胁迫下香果树花青素合成相关差异表达基因分析

2.3.3 抗氧化酶相关差异表达基因分析 高光胁迫下香果树抗氧化酶差异表达基因分析结果(表8)显示：Fe-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT1、CAT2、CAT3、PER2、PER12、PER48、APX1和APX3基因的表达水平均显著上升。

2.3.4 脱落酸合成及信号通路相关差异表达基因分析 高光胁迫下香果树脱落酸合成及信号通路相关差异表达基因分析结果(表9)显示：NCED1和NCED3基因的表达水平显著下降，BGLU11、BGLU23、BGLU24、BGLU34和BGLU46基因的表达水平显著上升，而催化脱落酸分解的关键酶8′-羟化酶基因CYP707A的表达水平显著下降。另外，编码脱落酸受体PYR/PYL蛋白家族的基因PYR/PYL以及对脱落酸信号通路起正向调控作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2C的编码基因SnRK2C的表达水平显著上升，而对脱落酸信号通路起负向调控作用的蛋白磷酸酶2C 51的编码基因PP2C51的表达水平却显著下降。

表8 高光胁迫下香果树抗氧化酶相关差异表达基因分析

表9 高光胁迫下香果树脱落酸合成及信号通路相关差异表达基因分析

2.4 高光胁迫下香果树差异表达基因的qRT-PCR验证

为验证基于RNA-seq技术检测的香果树转录组数据的可靠性，从上述差异表达基因中随机选择8个显著差异表达的基因进行qRT-PCR验证。统计结果(表10)表明：在RNA-seq检测结果中，这8个差异表达基因的表达水平与qRT-PCR检测结果一致，说明基于RNA-seq技术的香果树差异表达基因表达水平分析结果真实、可靠。

表10 基于RNA-seq和qRT-PCR技术的高光胁迫下香果树8个差异表达基因表达水平的比较

3 讨论和结论

3.1 香果树响应高光胁迫的光合通路分析

捕光复合物(light harvesting complex, LHC)是一种特殊的蛋白质，在植物进行光合作用的过程中发挥着吸收和传递光能的重要功能。通常认为，LHCⅠ包括Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4蛋白，LHCⅡ包括Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4(CP29)、Lhcb5(CP26)和Lhcb6(CP24)蛋白[16,17]。其中，CP29、CP26和CP24除了收集太阳能并将其转移到反应中心外，还可以在高光照条件下耗散多余的激发能，起到光保护作用[18]。在高光胁迫下，拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕Lhca1-4和Lhcb1-6基因的表达水平显著下调[19]，香果树Lhca4、Lhcb1、Lhcb2和Lhcb5基因的表达水平也显著下调。据此推测，高光胁迫可能导致香果树部分捕光复合物数量减少，致使叶绿体的捕光能力下降，相关光保护能力也同时降低。

本研究结果显示：在高光胁迫下，编码香果树光系统Ⅰ中反应中心蛋白的基因psaA、psaE、psaG、psaH、psaK、psaL和psaO的表达水平显著下调，这一研究结果与拟南芥的相关研究结果一致[19]。最新研究发现，叶绿体NADP库的大小随光照强度变化而改变，叶绿体可根据NADP库的大小调整PsaA和PsaB蛋白的合成速率，从而改变光系统Ⅰ的数量和活性，并且PsaA和PsaB蛋白合成的调控是在蛋白质翻译阶段而不是转录阶段[20]。那么，高光胁迫下香果树反应中心蛋白转录水平下降与光系统Ⅰ数量和活性的变化究竟有何直接关系，尚待进一步深入研究。

在光系统Ⅱ中，psbB和psbC基因编码的核心天线复合物CP47和CP43以及PsbO、PsbP、PsbQ、PsbR均与光系统Ⅱ的放氧活性密切相关[21]，PsbK和PsbW对光系统Ⅱ的结构稳定起到关键作用[22]；PsbS在qE型非光化学猝灭中起重要作用，可保护植物免受过量光照引起的光损害[23]。本研究中，高光胁迫下，香果树的psbC、psbK、psbO、psbP、psbQ、psbR和psbW基因的表达水平显著下降，而psbS基因的表达水平显著上调，表明高光胁迫抑制了光系统Ⅱ的结构蛋白和放氧复合物核心蛋白的表达，同时激活了光损伤保护机制。最近研究证实，光系统Ⅱ是植物光损伤的关键部位，过量光照导致放氧活性中心蛋白的氧化损伤和放氧活性丧失，核心蛋白亚基D1、D2、CP47和CP43发生明显的降解和解离[24]。然而，关于香果树光损伤的分子机制尚未明确，应将转录组学和蛋白质组学方法结合起来进行研究。

高光胁迫下，香果树细胞色素b6f复合物基因petA、petC和petG，质体蓝素基因petE以及ATP合成酶相关基因atpC1和atpI的表达水平均显著下调，表明高光胁迫下香果树的光合电子传递过程和光合磷酸化过程均受到影响。对高光胁迫下拟南芥的研究结果显示：其细胞色素b6f复合物基因petM的表达水平显著下调，但ATP合成酶基因的表达水平并没有发生明显变化[19]。表明不同植物种类对高光胁迫的响应机制存在差异。

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶是光合作用碳同化过程中的关键酶，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶是调控核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的关键酶[25]。在高光胁迫下，香果树核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大、小亚基的编码基因以及核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶基因的表达水平显著下调，推测这可能会造成核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性明显下降。谷氨酰-tRNA还原酶和原叶绿素酸酯氧化还原酶是叶绿素生物合成途径中的关键酶[26]，在高光胁迫下，这2种酶相关基因的表达水平显著下调可能是造成香果树叶绿素含量显著降低的重要原因。

3.2 香果树响应高光胁迫的花青素代谢通路分析

研究发现，强光可诱导植物体内花青素的积累[27]，而花青素对强光有过滤作用，可减轻光系统Ⅱ的光损伤程度[23,28]。大量研究表明：花青素合成相关基因的表达以及花青素的积累受到MYB和bHLH转录因子的调控[29-31]，其中，MYB6、MYB7、MYB8、MYB12、MYB36、MYB111和MYB113可正向调控拟南芥叶、毛白杨(PopulustomentosaCarr.)叶、紫胡萝卜〔Daucuscarotasubsp.sativus(Hoffm.) Arcang.〕肉质根、月季(RosachinensisJacq.)花瓣、海棠〔Malusspectabilis(Ait.) Borkh.〕叶、丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)花中花青素的合成[19,32-36]；bHLH类转录因子GL3可促进‘红阳’猕猴桃(Actinidiachinensis‘Hongyang’)果实中花青素的合成[37]。本研究中，高光胁迫下，编码香果树花青素合成酶的基因PAL、CHS、F3H、UFGT6和UFGT3的表达水平显著上调，与花青素合成相关的转录因子编码基因MYB6、MYB7、MYB8、MYB12、MYB36、MYB111、MYB113和GL3的表达水平也显著上调。说明在高光胁迫下，这些转录因子可能通过对香果树花青素合成相关基因表达的正向调控来控制花青素的合成，从而使花青素积累显著增加。前人的研究表明，参与调节花青素合成的转录因子主要包括3类，即R2R3-MYB、bHLH和WD40，这些转录因子通常通过形成MYB-bHLH或MYB-bHLH-WD40复合物来调控花青素的合成[38]。关于香果树中MYB和bHLH转录因子之间是否存在互作关系以及二者之间的互作机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

3.3 香果树响应高光胁迫的抗氧化酶系统分析

Hao等[12]认为，高光胁迫会导致光系统中的活性氧过度积累，对光系统Ⅱ造成损伤并引起光抑制。植物活性氧的清除主要依赖于体内的抗氧化酶(如SOD、POD、CAT和APX等)[24,39]。在高光胁迫下，香果树SOD、POD、CAT和APX的活性显著升高，且香果树Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、CAT1、CAT2、CAT3、PER2、PER12、PER48、APX1和APX3基因的表达水平显著上调。说明香果树可能通过在转录水平促进相关抗氧化酶基因表达来调控抗氧化酶活性，从而提高其清除自由基的能力。

3.4 香果树响应高光胁迫的脱落酸代谢及信号通路分析

脱落酸在植物体内的积累不仅与脱落酸的生物合成和分解代谢相关，也与脱落酸糖基水解酶催化的无活性脱落酸向有活性脱落酸转化的过程有关[40]。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是催化脱落酸生物合成的关键酶[41]。CYP707A1、CYP707A2、CYP707A3和CYP707A4这4种细胞色素P450单加氧酶是脱落酸分解代谢的关键酶[42]。高光胁迫下，尽管香果树脱落酸合成关键酶基因NCED的转录表达显著下调，但是催化无活性脱落酸向有活性脱落酸转化的脱落酸糖基水解酶的基因BGLU显著上调表达，同时催化脱落酸分解的细胞色素P450单加氧酶基因CYP707A表达量显著下调。说明高光胁迫下香果树脱落酸水平升高可能是由脱落酸分解速率下降和有活性脱落酸含量增加造成的。

脱落酸是植物响应逆境胁迫的重要信号分子[43]。环境胁迫可诱导植物体内的脱落酸水平升高，脱落酸与其受体PYR1/PYLs结合后即可启动脱落酸信号转导途径，ABA-PYR1/PYLs受体复合物与蛋白磷酸酶2C(PP2C)结合，从而释放在静息状态下被PP2C抑制的SnRK2s激酶；SnRK2s被激活后可磷酸化下游的bZIP类转录因子(包括ABIs等)，从而激活下游基因，引起植物产生生理生化变化[44]。本研究结果显示：高光胁迫下香果树的脱落酸受体基因PYR/PYL、脱落酸核心信号元件蛋白磷酸酶激酶基因SnRK2C的表达水平显著上调，而脱落酸信号途径的负调控因子PP2C的编码基因PP2C51的表达水平显著下调，表明高光胁迫可促进香果树体内脱落酸的积累，进而激活脱落酸信号转导途径。在对拟南芥的研究中，尽管脱落酸水平受高光胁迫诱导显著增加，但多数脱落酸受体基因的表达量下调，而几乎所有的PP2C类磷酸酶基因却显著上调[19]，这与香果树的研究结果存在明显差异。可见，脱落酸调控不同植物响应高光胁迫的机制可能存在较大差异。

3.5 结论

综上所述，高光胁迫下香果树的生理生化变化与相关差异表达基因的表达水平变化一致，且这些差异表达基因主要富集在光合作用、氧化还原、植物激素代谢和信号转导、次生代谢等通路中，初步推断香果树主要通过调控光合作用、抗氧化酶系统、脱落酸代谢及信号通路、花青素代谢通路响应高光胁迫。