药物性牙龈肥大动物模型的建立及相关机制

李佳博，臧文丽，潘亚萍

药物性牙龈肥大(drug-induced gingiva enlargement，DIGE)是指长期服用某些药物而引起牙龈组织的纤维性增生和体积增大，相关常见药物包括：抗癫痫药、钙通道阻滞剂、免疫抑制剂等[1]。DIGE表现为发生于龈乳头和附着龈的显著纤维性增生，可覆盖大部分或全部牙冠，妨碍口腔功能，影响卫生及美观。病理表现为纤维增生、细胞外基质积累，其相关机制涉及成纤维细胞增殖及凋亡异常、基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制酶失衡、上皮间充质转化等[2]。除药物直接作用外，牙龈组织对菌斑等刺激因素的反应性改变、个体易感性(年龄、性别、遗传因素等)均影响DIGE的发生发展。

动物实验是研究DIGE的重要环节，而DIGE动物模型的建立是体内研究的基础。本文旨在对动物模型的基本建模方法、影响因素及其相关机制进行回顾总结。

1 造模动物

1.1 动物种属

目前，大鼠、小鼠、犬、猫及灵长类动物被应用于DIGE的建立，其中大鼠以其价格低廉、易于饲养、药物敏感性强等原因应用最为广泛。大鼠磨牙及牙周组织形态与人类相似，每个象限有一颗切牙及三颗磨牙。大鼠DIGE模型中下颌牙龈肥大重于上颌[3]，切牙区重于磨牙区，颊侧大于舌侧[4]，这与人类DIGE好发于前牙及颊侧表现一致。实验显示DIGE发生率及严重程度在Fisher大鼠及SD大鼠间无统计学差异[5]。有研究者使用猴子[6]、猫[7]及比格犬[8]建立动物模型，但这些动物饲养难度及成本更高，且其牙龈肥大表现与人类差异较大。

1.2 动物年龄

Ishida等[9]的实验中给予20、40 d及90 d龄大鼠相同剂量硝苯地平灌胃，发现仅在20 d龄组成功诱导DIGE。Morisaki等[10]的研究显示相同给药时间情况下，30 d龄大鼠DIGE发生率为15 d龄大鼠的55%。药理学及毒理学实验中多采用4周龄大鼠，因该年龄药物敏感性最强。大鼠约8周龄时性成熟，成年大鼠药物敏感性显著下降，这可能与高龄大鼠细胞外基质分泌能力及酶活性下降有关[11]。选用低龄大鼠(2～4周龄)可引起更明显的牙龈肥大。

1.3 动物性别

雄性大鼠较雌性大鼠更易感，且诱导雄性大鼠发生DIGE的所需血药浓度阈值低于雌性。雌性大鼠通过卵巢切除术减少血浆黄体酮浓度后牙龈肥大程度为对照组的1.4倍[12]，而雄性大鼠受激素影响较小，更易诱导出相关模型[9]。临床DIGE男性患病率高于女性，Barak等[13]报道硝苯地平引起的DIGE男女比例约为5∶1。Chang等[14]发现硝苯地平和雄激素受体(androgen receptor，AR)基因启动子5′-非编码区的结合激活AR表达。由此可见，激素是DIGE的重要影响因素。

2 药 物

2.1 药物种类

钙通道阻滞剂中硝苯地平最易引起大鼠DIGE。有学者通过测量大鼠牙周探诊深度，认为单位摩尔药物引起牙龈肥大的能力环孢素>硝苯地平>苯妥英钠[12]。有研究显示环孢素引起全口牙龈广泛增生，而尼群地平引起下颌前牙颊侧牙龈局部增生[8]。尽管上述三类药物诱导的DIGE有相似临床症状，但其药物作用途径及致病机制不尽相同，环孢素引起的DIGE中炎症程度较高，硝苯地平次之，苯妥英纳则以纤维化为主，几乎没有炎症[15-16]。

2.2 给药方式

常见给药方式包括饮食、灌饲、腹腔注射、皮下注射、静脉注射、局部应用等。以饮食方式给药，动物损伤小，但难以控制药物准确剂量。难溶于水的药物多制备为0.5%羧甲基纤维素钠悬浊液形式进行灌胃给药，服药时间固定且剂量准确[17]。环孢素及苯妥英钠多以皮下注射[18-19]和灌饲方式给药[4]，Assaggaf等[20]通过小鼠皮下泵类缓释装置控制药物流速以维持血药浓度。Zhao等[21]将苯妥英钠制备为缓释微球，手术缝合于牙龈组织中，使牙龈退缩大鼠牙龈厚度增加[21]。人龈沟液及唾液内药物浓度远高于血药浓度[22]，动物模型中局部药物传递系统的应用或能更准确模拟DIGE的发生。

2.3 药物剂量

研究显示牙龈肥大程度与药物剂量呈正相关关系，高剂量组较低剂量组牙龈增生明显[9]。这在临床流行病学研究中也得到证实，大剂量药物服用者DIGE发生率更高。尽管目前动物实验中给药剂量远低于毒理学大鼠药物致死剂量，但多项研究中给药组大鼠体重增加显著低于对照组，高剂量硝苯地平(250 mg/(kg·d))可抑制幼龄大鼠生长[9]。血药浓度中，峰值及谷底浓度都值得关注。研究显示引起镜下可见牙龈肥大所需的最低血药浓度分别是5 μg/mL(苯妥英钠)、600 ng/mL(环孢素)以及800 ng/mL(硝苯地平)[12]。苯妥英纳及环孢素给药剂量约等于其治疗剂量[23-24]，硝苯地平给药剂量远高于人体治疗剂量[25]。

2.4 给药时间

人DIGE常在服药3个月后出现，9～12个月达高峰，这可能与牙龈组织细胞增殖凋亡周期有关。大鼠DIGE模型多需4～6周[26]，比格犬5个月建立完成(约为人类2年)[8]，牙龈增生程度随时间增加而增加。研究显示大剂量硝苯地平(250 mg/(kg·d))引起的DIGE于20 d达峰值，延长给药时间不会出现更多增生肥大[12]。Fu等[26]的研究显示给药6周内牙龈肥大程度不断增加，于6周达峰值，延长给药至8周组牙龈肥大与6周组无统计学差异。与DIGE临床表现类似，动物实验中停药后牙龈肥大可自行缓解或消失[12,27]。

3 建模方法

3.1 长期药物过量法

通过6至8周的过量给药可引起实验动物普遍牙龈肥大表现，血药浓度达阈值时DIGE发生率可达100%[4, 12]。大鼠牙龈组织切片观察到类似人类DIGE的组织学及病理学表现，牙龈厚度及高度增加、上皮增生、上皮钉突伸长、胶原纤维堆积、炎症细胞浸润等，表明建立了可靠的DIGE模型[4]。与之不同的是，人类DIGE是相关全身药物引起的牙龈组织特异性反应，其临床发生率不等(苯妥英钠7%～83%，环孢素8%～80%，硝苯地平30%～50%),流行病学研究显示存在反应者及非反应者，二者服药剂量及服药时间无统计学差异[28]。由此可见，动物模型中药物为主要刺激因素。

3.2 药物结合牙周炎法

单纯药物过量法关注药物的直接作用，难以模拟人类DIGE中多因素相互作用，因此有学者使用牙周炎模型配合过量药物诱导DIGE。Wu使用结扎丝单侧结扎大鼠第一磨牙并设置自身对照，每日灌胃硝苯地平50 mg/kg，发现结扎侧DIGE较对照侧明显，早期结扎促进细胞因子基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的表达，而建模后期药物对该类因子起抑制作用[29]。Morisaki等[3]使用硝苯地平联合大鼠口腔接种链球菌MT8148，处理53 d后发现加菌组探诊深度大于无菌组。而Fernandes等[30]使用棉线结扎大鼠上颌第二磨牙并给予硝苯地平刺激，认为药物本身无法引起牙龈增生，当炎症存在时硝苯地平可加剧牙龈肥大和牙周组织炎症。Okanobu等[27]的研究也认为炎症是环孢素诱发DIGE的促进因素，研究同时显示药物不会增加附着丧失及牙槽骨吸收[3]。目前学者多使用单纯结扎法刺激牙龈组织产生局部炎症，局部炎症存在情况下，相对低剂量的药物即可引发DIGE。这与临床研究结果相符，横断面研究发现反应者较非反应者牙周状况更差，牙周炎患者牙龈肥大发生率更高，临床通过牙周基础治疗可消除或缓解DIGE[28]。

3.3 多重药物法

已知多种不同药物可引起相似的牙龈肥大表现，临床常见同时服用降压药及免疫抑制剂的肾脏移植患者发生严重DIGE。大鼠研究显示环孢素联合硝苯地平较单一药物可引起更明显的增生[17]。但也有学者联合应用他克莫司和硝苯地平引起的牙龈增生与单一用药组无统计学差异[31]，这与临床表现相悖[32]，可能是药物浓度及药物作用时间不足的原因。

4 动物模型应用

4.1 药物治疗

临床研究显示约47.2%的DIGE患者在牙周支持治疗阶段再次出现牙龈肥大并需要再次治疗[33]。由于大多数患者终生持续服药，手术后仍有复发风险[22]。使用药物干预DIGE可以起到预防、减轻以及辅助常规治疗的作用。Ma等[34]在环孢素诱导的大鼠DIGE中发现丹参酮(Tan ⅡA)与环孢素联用较单纯环孢素组转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β1表达下调，基质金属蛋白酶染色浓度增强。Assaggaf等[20]通过以微渗泵方式给药，发现洛伐他汀对环孢素引起的小鼠牙龈肥大有预防作用，洛伐他汀减少了上皮-间充质转化相关标识物TGF-β1的表达，并部分减弱了苯妥英钠下调E-cadherin的作用。

4.2 基因研究

临床DIGE发生率远小于实验性DIGE揭示人类个体的药物代谢能力具有明显遗传异质性，反应者及非反应者牙龈成纤维细胞的转录组学分析证明了这一点[35]。Staudinger等[36]使用环孢素处理野生型、敲除及过表达盘状结构域受体(discoidin domain receptor，DDR)1小鼠的成纤维细胞，发现环孢素以DDR1依赖方式抑制细胞与胶原的结合、细胞在胶原上的迁移、胶原内化及收缩。Alshargabi等[37]药物处理过表达SPOCK1的转基因小鼠，观察到显著牙龈肥大及与上皮-间充质转化相关的纤维化表型。已知多种基因及其代谢产物影响成纤维细胞异质性、胶原合成、胶原溶解活性、药物受体结合及代谢，如细胞色素P3A5[38]、核受体4A1[39]。这些理论通过恰当的动物模型验证，将更有说服性并提供新的研究思路。

4.3 动物模型的优势与局限

实验性DIGE与人类DIGE具有相似的组织学及病理学表现，造模周期短，影响因素可控。在临床治疗及取材面临伦理限制的情况下，小鼠及大鼠模型使药物研究及基因层面研究成为可能。

目前的造模方法多关注药物、牙周状况等影响因素，而忽略了全身因素，如癫痫、高血压、器官移植引起的免疫反应，而这些因素已知与牙周病关系密切[40]，这可能需要研究者同时建立两个或两个以上动物疾病模型。

5 结 语

近年来我国心血管疾病、器官移植患者人数呈增长趋势，相关药物使用率增加且具有长期性及不可替代性，牙周基础治疗及手术治疗不能完全解决DIGE问题，更多的机制及新型治疗方法研究有赖于动物模型的建立。动物牙龈肥大模型涉及较多药理学知识，如何根据研究目的建立更合理的动物模型，仍需深入实践和探索。