西洋参茎叶体外抑制大肠杆菌增殖及抗炎活性的研究

葛 楠， 董 鑫， 肖开颜， 王江木， 程 雷， 王彦珺， 苏凤艳*

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.青岛市中医医院，山东 青岛 266000）

随着人们生活水平的提高，对畜禽食品的质量和安全性提出了更高的要求，健康安全的食品成为人们最关心的问题之一（苗旭等，2020）。然而在发展迅猛的饲料工业中，人工合成添加剂的滥用严重危害了食品安全，因此人们越来越重视饲料添加剂的安全问题，特别是对饲料添加剂的生产和使用提出了更严格的要求（高铎等，2021；池永宽等，2020）。

中草药饲料添加剂以中草药物间关系和中兽医理论为主，以饲养和饲料学科理论为辅，将有助于预防疾病的中草药添加到动物饲粮中，以此达到替代抗生素的目的（穆柳梅等，2018）。西洋参作为我国传统道地药材，具有极其丰富的药用价值，近年来有关西洋参根部的报道甚多，然而其茎叶的利用程度较低。宋月等（2016）研究表明，西洋参茎叶对机体有增强免疫力的作用，通过对西洋参茎叶的合理利用可提高我国中草药资源产业循环可持续发展（胡露等，2020）。本研究以西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位作用于大肠杆菌诱导细胞凋亡模型和脂多糖（LPS）诱导细胞炎症模型，探讨西洋参茎叶体外抑制大肠杆菌增殖和抗炎活性，为后续西洋参茎叶作为中草药饲料添加剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1药物与试剂 试验用西洋参茎叶采自吉林省集安市，经吉林农业大学中药材学院教授鉴定为五加科人参属植物西洋参（Panax quiquefolium L.）的地上部分；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；DMEM细胞营养液，北京索莱宝生物技术有限公司；胎牛血清，美国Gibco；脂多糖（LPS），北京索莱宝生物技术有限公司；Hoechst染色试剂，杭州维特洁生化技术有限公司；总RNA提取试剂盒，北京索莱宝生物技术有限公司；TB GreenRPremix Ex TaqTMII，宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2细胞株 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自武汉普诺赛生物科技有限公司，置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，选择对数生长期的细胞用于试验。

1.3主要仪器Galaxy 170S CO2恒温培养箱，NEW Brunswick公司；倒置荧光显微镜，日本OLYMPUS；超微量快速核酸蛋白测定仪（UV-1800），日本岛津；实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf公司。

2 试验方法

2.1西洋参茎叶水提取部位的制备 取西洋参茎叶和热水按料液比1∶35于圆底烧瓶，将圆底烧瓶置于90℃恒温水浴锅中，提取2 h，过滤、浓缩即得西洋参茎叶水提取部位，低温冷冻干燥备用。

2.2西洋参茎叶醇提取部位的制备 取西洋参茎叶和60%浓度甲醇按料液比1∶40于圆底烧瓶，将圆底烧瓶置于80℃水浴锅中，回流提取2 h，过滤，旋转蒸发回收除尽滤液中的甲醇，制得西洋参茎叶醇提取部位，低温冷冻干燥备用。

2.3提取物溶液的配制 将冷冻干燥得到的西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位冻干粉用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM细胞营养液溶解并梯度稀释配制成浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL，将制得的溶液过0.22 μm无菌滤膜，4℃保存备用。

2.4细胞分组 收集处于对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，设置空白组、对照组和试验组，其中试验组分为西洋参茎叶水提取部位组和西洋参茎叶醇提取部位组。

2.5 CCK-8法检测细胞增殖率 细胞分组同2.4，每组设3个重复，接种后于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞长至孔底80%时，弃去原营养液，试验组加入提取物溶液，空白组和对照组加入细胞营养液，于培养箱中继续培养，提取物作用刺激12 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱中继续避光孵育2 h，孵育结束后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光度值（A450），计算细胞增殖率，确定西洋参茎叶提取物安全试验浓度。

2.6 Hoechst染色法检测细胞凋亡 调整细胞密度为2×105个/mL接种于细胞培养板，细胞分为空白组、大肠杆菌侵染组和试验组，待细胞长至孔底80%时，空白组加入细胞营养液，大肠杆菌侵染组加入大肠杆菌菌液，试验组加入提取物溶液和大肠杆菌菌液，培养结束后进行Hoechst染色，于荧光显微镜下观察细胞形态。

2.7西洋参茎叶对LPS诱导的细胞形态的影响收集处于对数生长期的细胞，将细胞分为空白组、LPS组和试验组，每组设三个重复孔，空白组加入含10% FBS的细胞营养液，试验组和LPS组加入提取物溶液和终浓度1 μg/mL LPS溶液，培养12 h，于倒置显微镜下观察各组细胞形态。

2.8 ELISA法检测IL-6、IL-1β和TNF-α的含量 将细胞接种于6孔细胞培养板，共设8个组，分别为西洋参茎叶水提取部位0.125、0.25、0.5 mg/mL低中高3个试验组，西洋参茎叶醇提取部位0.125、0.25、0.5 mg/mL低中高3个试验组，LPS阳性对照组和空白对照组，每组设3个重复孔，试验组每孔加入相应浓度提取物的细胞营养液，阳性对照组加入1 μg/mL的LPS，空白对照组加入细胞营养液，培养12 h，收集细胞上清液，根据ELISA检 测 试 剂 盒 说 明 书 测 定IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。

2.9实时荧光定量PCR法检测LPS诱导细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α基因表达量 试验分组处理同2.8，细胞培养结束后，提取细胞总RNA，并反转录为cDNA，按照SYBR Green PCR试剂说明，以cDNA为模板扩增目的基因，引物序列见表1，引物由上海生工生物有限公司进行引物合成。

表1 引物序列

3 试验结果与分析

3.1 CCK-8法检测细胞增殖率 如图1所示，随着提取物浓度的升高，细胞增殖率先升高后降低，当西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位提取物浓度为0.25 mg/mL时，细胞增殖率最高，升高了40.96%，且较空白对照组差异显著（P<0.05），因此选择0.125、0.25、0.5 mg/mL三个浓度用于后续试验。

图1 不同浓度西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位对RAW264.7细胞增殖率的影响

3.2 Hoechst染色法检测细胞凋亡 如图2和图3所示，空白组细胞凋亡非常少，蓝色荧光细胞数量最少，大肠杆菌组有大量蓝色荧光细胞，出现明显的凋亡现象，西洋参茎叶提取物组正常形态细胞数量较多，蓝色荧光细胞数量有所减少，且当西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位浓度为0.25 mg/mL时，凋亡细胞数量最少。

图2 西洋参茎叶水提取部位对大肠杆菌诱导的细胞凋亡情况的影响

图3 西洋参茎叶醇提取部位对大肠杆菌诱导的细胞凋亡情况的影响

3.3西洋参茎叶对LPS诱导的细胞形态的影响如图4和图5所示，空白组细胞形态正常，无长梭形细胞，LPS组的细胞形态呈长梭形，伪足伸长，试验组细胞形态较LPS组相比，长梭形状态细胞数量减少，细胞形态渐趋于正常，且当西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位浓度为0.25 mg/mL时，细胞形态趋于正常。

图4 西洋参茎叶水提取部位对LPS诱导的细胞形态的影响

图5 西洋参茎叶醇提取部位对LPS诱导的细胞形态的影响

3.4 ELISA法检测IL-6、IL-1β和TNF-α的含量 如表2所示，与空白组和试验组相比，LPS组的细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6细胞炎症因子浓度分别升高了1077.87%、699.36%、881.68%，且差异显著（P<0.05）。与LPS组相比，当西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位提取物浓度为0.25 mg/mL时，细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6细胞炎症因子浓度分别降低了50.20%、22.21%、43.41%；西洋参茎叶醇提取部位提取物浓度为0.25 mg/mL，细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6细胞炎症因子浓度分别降低了59.70%、30.24%、52.38%，且有显著差异（P<0.05）。

表2 西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α的影响（n=3）

3.5实时荧光定量PCR法检测LPS诱导细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α基因表达量 如图6所示，与空白对照组相比，LPS诱导的细胞其炎症因子基因的表达量升高了250.11%，且差异显著（P<0.05），与LPS组相比，试验组的细胞炎症因子基因表达量降低，当西洋参茎叶水提取部位浓度为0.25 mg/mL时，TNF-α、IL-6和IL-1β基因表达量分别降低了12.31%、27.07%、29.01%；西洋参茎叶醇提取部位浓度为0.25 mg/mL时，TNF-α、IL-6和IL-1β基因表达量分别降低了21.54%、29.84%、31.79%，且有显著差异（P<0.05）。

图6 西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位对细胞IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达的影响

4 讨论

近年来，人们对食品安全性的要求越来越高，但养殖业中抗生素的滥用不仅导致动物机体产生耐药性，而且会导致人类在食用动物源性食品时存在致畸、致癌、致突变隐患（姚爽，2021）。研究表明，中草药饲料添加剂可提高动物机体免疫机能且不易产生有害残留，具有抗菌活性（孙晓磊，2021），可提高畜禽免疫力和生产性能，提高动物源性食品的安全质量（苏美等，2021）。中草药饲料添加剂的开发与利用在猪、鸽、反刍动物等动物养殖过程中越来越广泛，赵炳凯等（2009）研究发现，中草药饲料添加剂可以增强细胞吞噬能力，抑制病毒从而增强免 疫 力；赵 凤 至（2014）、孔 娜（2015）等 研 究 发现，肉鸡饲粮中添加中草药成分可以增强肉鸡、乳鸽的机体免疫功能；乔玉霞（2016）研究发现，中草药饲料添加剂可以提高仔猪抗病毒能力，调节菌群平衡；Gao（2013）等研究发现，中草药饲料添加剂可明显提高奶牛生产性能。

西洋参茎叶是西洋参的地上资源，具有综合开发利用价值（李伟等，2021）。汪亚菁等（2016）研究证实，西洋参茎叶中皂苷和多糖含量是根中的两倍，杨修仕等（2014）研究表明，西洋参多糖具有较强的免疫增强活性；赵云利等（2011）研究发现，西洋参皂甙能提高小鼠巨噬细胞的吞噬功能，张明（2010）、徐菁菁（2015）等试验证实，西洋参皂苷和多糖对大肠杆菌均具有一定的抑制作用。本试验用CCK-8法亦证实西洋参茎叶水提部位和醇提部位均可增强RAW264.7细胞的增殖能力，本试验采用Hoechst染色法观察大肠杆菌诱导细胞凋亡的情况，证实西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位对大肠杆菌均有一定的抑制效果，与前人研究结论一致。本试验亦发现西洋参茎叶水提取部位和醇提取部位均可显著抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α的释放，并显著降低IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA基因表达量。本研究发现西洋参茎叶的水提取部位和醇提取部位均具有一定的抑菌和抗炎活性，为西洋参茎叶作为中药饲料添加剂的利用与开发提供了理论依据。