羊膜修复肌腱、韧带损伤的研究进展

张加廷 江涛 张佳 肇刚 魏钰 安明扬 李春宝 刘玉杰*

羊膜是胎盘的最内层，位于胎儿旁边，由一层厚的基底膜和一层无血管基质组成[1]，每年可以从数百万新生儿中收集到。研究表明，羊膜含具有分化潜能的干细胞及血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）和粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）等生物活性因子[2]。生物羊膜作为组织工程中的重要成员，在眼科、烧伤整形科、耳鼻喉科等专业领域已有大量的研究和临床应用。而其在肌腱损伤修复领域的研究和应用相对较少，对未来应用于肌腱、韧带损伤的修复具有巨大的前景。本文就羊膜在肌腱、韧带损伤修复方面的相关研究作一概述。

1 羊膜概述

羊膜（amniotic membrane，AM）是胎盘的最内层，紧邻胎儿，半透明，厚0.02 ～0.05 mm，为无血管和血供的组织，由3 层组成。上皮层：由大量微绒毛、代谢旺盛的单层立方体上皮细胞构成；基底层：含有Ⅳ型和Ⅶ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和透明质酸；无血管间质层：可细分为3层结构，由内到外分别是内致密层、具有疏松成纤维细胞网络的中间成纤维细胞层，以及最外层几乎无细胞的海绵层。基质主要含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ型胶原[3]。

羊膜上皮细胞有助于羊水的动态平衡，而细胞内空泡的存在表明有一定的分泌活动[4]。羊膜能够允许水和可溶性化合物的运输，产生生长因子，如上皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受体、角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）及其受体，以及转化生长因子TGF-α，TGF-β1、β2和β3亚型[5]。此外，羊膜还分泌白细胞介素6和8转化羊水干扰素-c以及血管活性肽，表现出促进上皮化、抗纤维化、抗炎抗血管生成和抗微生物侵袭等特征，维持生理湿润微环境，从而减少水分流失，促进伤口愈合[6]。

1.1 抗纤维化和抗炎特性

羊膜的抗纤维化作用是通过抑制TGF-β信号，减少TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3亚型和TGF-βⅡ型受体的表达来实现的。羊膜的抗炎作用是通过抑制促炎细胞因子，如白介素IL-1a、IL-2、IL-8、IL-10、IFN-c、bFGF、肿瘤坏死因子、血小板衍生生长因子的表达来驱动的[7]。羊膜的这些抗炎和抗纤维化作用也被认为是通过在上皮细胞和间质细胞上的FAS受体介导了相关细胞的凋亡表达[8]。

1.2 抗血管生成特性

羊膜的抗血管生成作用是通过合成有效的抗血管生成化合物，包括血小板反应素-1、内皮抑素和金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和TIMP-4）。尽管如此，组织工程中羊膜的抗血管生成作用（导致组织缺血）必须与其他潜在益处相平衡考虑[9]。

1.3 抗微生物特性

羊膜和羊水的抗微生物作用归于羊水中存在杆菌素、β-溶酶、溶菌酶、转铁蛋白和7-S免疫球蛋白。此外，羊膜作为一种有效的物理屏障，由于其与伤口表面的紧密黏附，可以防止潜在的感染进入修复组织的内部[10]。

1.4 免疫调节作用

最初认为羊膜细胞表面没有主要的组织相容性抗原HLA-A、HLA-B或HLA-DR，但研究进一步表明，羊膜上皮细胞和间充质细胞有限表达HLA-Ia 类（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR）和Ib 类（HLA-E、HLA-G）抗原。然而，移植冷冻保存的羊膜并不会导致免疫排斥。羊膜的这一特点避免了羊膜移植中使用任何免疫抑制剂[11]。

2 羊膜在屈肌腱损伤修复中的抗粘连作用

肌腱与周围组织粘连是肌腱损伤修复中最常见的问题。实验动物多采用鸡或大鼠，以羊膜覆盖损伤的屈肌腱，观察术后关节活动度、组织学特点、力学性能等评价指标，研究表明羊膜可有效防止损伤肌腱修复后的组织粘连[12-15]。Liu等[16]利用鸡为实验动物，建立肌腱鞘缺损模型和Ⅱ区屈指肌腱模型，通过大体、组织学和生物力学对比研究，结果显示羊膜组炎症反应轻微，周围组织几乎无粘连，该研究团队认为羊膜作为腱鞘构建中的天然生物替代材料，促进内源性愈合，能有效抑制外源性愈合和防止肌腱粘连。在另一项临床研究中，研究者将89 例Ⅱ区屈肌腱损伤患者，分为对照组、聚DL-乳酸（PDLLA）组和羊膜组，分别于术后1、2、3、6、12个月随访，评价近侧和远侧指间关节主动屈曲和伸展活动，结果显示术后羊膜组较对照组的屈伸活动范围更好[17]。Leppänen 等[18]将手屈肌腱损伤手术患者的肌腱周围以羊膜包围，术后6 个月观察患者的手指活动范围，结果似乎并不理想，认为与现有技术相比，使用同种异体羊膜移植似乎不太可能在临床上产生预期的效果，但尚不确定不良结果是否与技术因素、同种异体羊膜移植物本身或并发症的偶发性有关。Ang 等[19]报道了1例33岁跟腱术后肌腱周围瘢痕增生并再断裂的患者，术中为防止瘢痕形成，在跟腱内放置了一半的羊膜移植物，用可吸收缝线固定其余一半的羊膜移植物。术后随访患者疼痛症状逐渐消失，并在术后2 个月可以穿运动鞋无痛行走，但遗憾的是作者并未对患者康复后的踝关节活动度做详细的描述。

3 羊膜促进急性肌腱损伤愈合

随着急性跟腱断裂疾病的增加，每年在10万人中约有18 人发生跟腱断裂。跟腱断裂后手术治疗发生肌腱纤维化、局部瘢痕粘连及伤口难以愈合等不良反应是临床医生不得不面对的问题[20]。McQuilling 等[21]以羊膜包裹缝合好的大鼠跟腱，在第2周、第4周分别进行组织学、免疫学、生物力学评价，实验结果表明羊膜处理过的实验组可以增加细胞迁移，提高跟腱的机械性能。该研究通过免疫荧光证明，在第14天和28天，脱水羊膜包裹处理组中scleraxis（Scx）持续高表达，认为该因子在肌腱再生与修复过程中发挥重要的作用。一项以大鼠为实验动物的急性跟腱损伤的动物模型中，同样显示人羊膜能够使跟腱愈合速度加快，炎症反应减轻，成纤维细胞活性增强[22]。de Girolamo 等[23]选择羊膜悬液治疗胶原酶诱导的跟腱损伤动物模型，发现治疗组所有肌腱在第28天组织变性均明显少于对照组。

Liu等[24]比较了人羊膜和小肠黏膜下层对兔跟腱损伤修复的影响，认为小肠黏膜下层比人羊膜在跟腱愈合早期能够更好改善损伤肌腱的生物力学特性并促进新血管形成。但此研究可能存在样本量不足以及缺乏修复跟腱的细胞及胶原定量分析，结论仍然需要进一步研究探讨。Coban等[25]的研究通过对断裂的跟腱注射羊水和羊膜，观察早期修复断裂肌腱的效果，该研究认为人羊膜和羊水对跟腱断裂早期的愈合过程没有任何影响。

Seo 等[26]在体外环境下分别将编织丝支架与包裹着羊膜的编织丝支架与肌腱细胞共培养，分别在第5、15、30 d采用MTT法测量两组支架上细胞增殖数量，结果显示包裹羊膜组编织丝支架上细胞数量明显多于单纯编织丝支架组。Murray等[27]建议理想的肌腱材料应在植入后起到早期支撑作用，待宿主肌腱组织再生后能够被完全吸收。羊膜材料与其他材料组合构建组织工程肌腱值得学者们进一步探索。

4 羊膜在慢性腱病中的应用

足跟疼痛是一种常见的慢性腱病，据报道美国大约有患者200万人。足底筋膜炎是足跟疼痛最常见的原因之一，可能是由各种软组织损伤及退变引起。足底筋膜炎和跟腱炎是严重的慢性疼痛疾病，但目前的治疗方法有限，组织工程疗法为此疾病的治疗带来了希望。近年来大量的研究证实人羊膜含有分化潜力的间充质干细胞及丰富的生物活动分子，具有减轻疼痛、降低纤维化、抑制细菌繁殖和改善局部炎性环境的能力，成为了治疗慢性肌腱疾病的方法之一。Werber[28]使用颗粒化羊膜和羊水治疗足底筋膜炎和顽固性跟痛症，经治疗患者疼痛症状明显减轻。Gellhorn等[29]通过超声引导下注射脱水人羊膜溶液治疗慢性肌腱病及关节病，通过对40 例临床病例长达9 个月的随访观察，经疼痛评分和患肢功能平稳系统评价治疗效果，显示所有病例尽管注射后可能会短时间局部疼痛增加，但是对羊膜注射后耐受性良好。此外随访发现脱水人羊膜注射液可以减轻患处疼痛并改善关节功能，止痛药使用率显著降低，患者对该疗法的满意度很高。

5 羊膜细胞相关研究

羊膜上皮细胞位于羊膜最表层，与胎儿直接接触。一些研究中羊膜上皮细胞已经被证实具有高度的可塑性及较高的分化能力[30]。事实上，羊膜上皮细胞在人和动物实验中都表现出低免疫原性和高免疫调节活性的特征。2005年Miki等[31]首次发现人羊膜上皮细胞具有在外源生长因子诱导下向全部3 个胚层分化的能力，从此越来越多的研究证实了此假设。有研究直接证明了人羊膜上皮细胞与肌腱细胞共培养可诱导羊膜上皮细胞向腱细胞分化[32]。在另一项利用人羊膜上皮细胞治疗早期跟腱损伤的研究中，通过检测人羊膜上皮细胞在早期部分缺损跟腱中的生物活性，发现经人羊膜上皮细胞处理的损伤肌腱在28 d内其结构和生物力学性能迅速恢复，与对照组有显著差异[33]。移植的羊膜上皮细胞在宿主肌腱内仍然存活，与内源性细胞相互作用。可能的机制为人羊膜上皮细胞通过分泌调节因子抑制炎症细胞浸润，激活M2 巨噬细胞亚群并进行早期募集，促进血管及细胞外基质重构，这一结论与另外一项研究证明羊膜上皮细胞调节诱导M1、M2型巨噬细胞的募集来促进损伤肌腱的修复相一致[34]。研究还发现部分原位分化的人羊膜上皮细胞表现为腱细胞样表型。这些研究证明了羊膜细胞在肌腱损伤治疗中的作用。近年来开始兴起的对人羊膜上皮细胞与肌腱损伤修复关系的研究结论较为一致，均认为羊膜上皮细胞能够有效促进损伤肌腱的再生与修复[35]。还有一部分研究证明羊膜间充质干细胞同样具有分化能力并能够在肌腱修复过程中发挥重要作用[36]。

6 羊膜的免疫调节作用

羊膜是胎盘最里面的一层，其免疫调节特性已经在眼科、皮肤再生、口腔黏膜修复等方面取得了较为成熟的成果。Hortensius等[37]以羊膜和胶原为材料制成复合支架，与腱细胞共培养，在炎性相关因子作用下，含有羊膜材料的支架中的腱细胞活性高于其他实验组，证明了羊膜抑制炎性反应并促进腱细胞活性。有研究认为，羊膜的免疫调节作用来源于羊膜上皮细胞分泌的细胞因子，将羊膜培养液应用于治疗马的肌腱和韧带损伤取得了满意的疗效[38]。该研究认为从马羊膜细胞培养液中提取的细胞外基质在体外发挥了免疫调节作用，促进肌腱损伤的愈合，此作用是通过细胞释放的生物活性因子发挥的，从而为我们提供了一种无细胞性肌腱损伤修复治疗的方法。虽然这种无细胞治疗应用前景广阔，但进一步了解羊膜中起关键免疫调节作用的细胞因子及其作用机制，如何更加安全的应用于临床治疗，仍需要进一步的研究和探索。

7 讨论

人羊膜作为肌腱、韧带损伤修复新的组织工程材料，具有容易获得、成本低廉、生物活性高、生物相容性及机械性能好的先天优势。目前，羊膜在肌腱损伤治疗中的应用形式有脱细胞羊膜、脱水羊膜、羊膜基质注射液、羊膜上皮细胞及间充质干细胞及其外泌体悬液等，近年来的研究表明，羊膜在促进肌腱愈合、减轻肌腱粘连、改善损伤肌腱微环境等方面有着较为理想的效果。但羊膜的作用机制及其相关影响因素仍不完全明确，羊膜在很多运动相关疾病中的应用值得进一步研究与探索。另外，临床缺乏成熟可用的运动医学领域羊膜组织工程的产品，需要研究者不断深化研究内容，完善应用条件，充实试验数据，开发具有显著疗效优势且安全可靠的医疗产品。总之，羊膜为肌腱与韧带相关损伤的治疗提供了新的思路。