基于RP-HPLC-DAD指纹图谱结合化学计量学评价不同品种木豆叶质量及主要成分含量测定

符丽娜，王立涛，王建栋，王燕秋，蔡子辉，闫鑫宇，赵棚权，张 谡，付玉杰

基于RP-HPLC-DAD指纹图谱结合化学计量学评价不同品种木豆叶质量及主要成分含量测定

符丽娜，王立涛，王建栋，王燕秋，蔡子辉，闫鑫宇，赵棚权，张 谡，付玉杰*

北京林业大学林学院，北京 100083

基于RP-HPLC-DAD指纹图谱结合化学计量学方法，评价不同品种木豆叶质量特征的共有性和差异性，为木豆叶的质量评价提供科学依据。通过RP-HPLC-DAD建立13个不同品种木豆叶的RP-HPLC-DAD指纹图谱，进行相似度分析（similarity analysis，SA），结合聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）对木豆叶质量进行综合评价，并对样品中6种主要成分进行含量测定。木豆叶RP-HPLC-DAD指纹图谱共标定13个共有峰，13个品种木豆叶的相似度均在0.90以上，通过HCA可将这13个品种的木豆叶分为5类。PCA与HCA结果基本一致，经过PCA分析发现S8的综合得分最高，质量最好，其次是S9和S12。PLS-DA与PCA结果基本一致，不同品种木豆叶的化学成分差异主要由7、10、6、9、11号5个色谱峰引起的。S8、S9和S12的含量处于前3，与PCA分析的综合得分一致。指纹图谱结合HCA、PCA和PLS-DA可以全面的评价木豆叶质量，为木豆叶的质量控制提供全面的参考。

木豆叶；指纹图谱；化学计量学；聚类分析；主成分分析；最小二乘判别分析；荭草苷；异牡荆苷；牡荆苷；木犀草苷；质量评价

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，搭配二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；匀质机（广州艾卡仪器设备有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）；BSA224S-CW型万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Multifuge×1R高效速冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；Cascada III.I5型超纯水系统（北京颇尔过滤器有限公司）。

1.2 材料

表1 木豆叶品种信息

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

精确称取1 g木豆叶样品，置于锥形瓶中，加50 mL 70%乙醇，高速匀质1 min，超声30 min提取1次，超滤或离心后用70%乙醇定容至50 mL，取上清液用0.22 μm的滤膜滤过备用。

2.2 对照品溶液的制备

2.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～10 min，20% B；10～20 min，20%～65% B；20～40 min，65%～80% B；40～45 min，80%～20% B；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为20 μL；检测波长为286 nm，色谱图见图1。

1-荭草苷 2-异牡荆苷 3-牡荆苷 4-木犀草苷 5-球松素 6-木豆酸

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批木豆样品S8（LP-1）1 g，精密称定，按“2.1”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积值，均以球松素为参比峰，测得S8样品13个共有峰的相对保留时间RSD均小于2.0%，相对峰面积RSD均小于5.0%。

2.4.2 稳定性试验 取同一批木豆样品S8（LP-1）1 g，精密称定，按“2.1”项下制备供试品溶液，在室温放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.3”项下色谱条件分别测定，记录峰面积值，以球松素为参比峰，测得S8样品13个共有峰的相对保留时间RSD均小于4.0%，相对峰面积RSD均小于10.0%。

2.4.3 重复性试验 取同一批木豆样品S8（LP-1）1 g，精密称定，按“2.1”项下的方法分别制备6份平行供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录峰面积值，以球松素为参比峰，测得S8样品13个共有峰的相对保留时间RSD均小于2.0%，相对峰面积RSD均小于5.0%。

3 结果与分析

3.1 指纹图谱的生成及共有峰的确定

取13个不同品种的木豆叶，分别按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，得到13个品种木豆叶的色谱图。将这13个不同品种木豆叶的色谱图以AIA格式导入由国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），以S9号样品的指纹图谱作为参照图谱，以平均数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.9 s，经多点校正、自动匹配后生成木豆叶指纹图谱的共有模式，13个品种木豆指纹图谱叠加图共标定共有峰13个（图2）。

5-荭草苷 6-异牡荆苷 7-牡荆苷 8-木犀草苷 11-球松素 13-木豆酸

3.2 相似度（similarity analysis，SA）评价

如表2所示，13个品种木豆与对照指纹图谱的相似度见表2，均在0.90以上，说明各品种木豆间相似度良好。

3.3 聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）

以木豆样品中13个共有峰的峰面积为变量，得到13×13阶原始数据矩阵，运用SPSS 19.0软件，采用组间连接法，以欧式平方距离为度量标准，对13个品种木豆样品进行HCA分析。当分类距离为15时，13个品种木豆样品可聚为5类，S4、S8、S12分别单独聚为1类，S3、S6、S11聚为1类，剩余品种聚为1类（图3）。

表2 13个木豆品种HPLC指纹图谱相似度评价

图3 13个品种木豆指纹图谱HCA分析的树状图

3.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

以木豆样品中13个共有峰的峰面积为变量，运用SPSS 19.0分析软件进行PCA分析，提取得到5个主成分，其特征值λ均＞1，累计方差贡献率为88.614%＞85%，可以代表样品88.614%的信息（表3），因子载荷矩阵见表4。第1主成分的信息主要来自于8、10、12和13号色谱峰；第2主成分信息主要来自3和10号色谱峰；第3主成分信息主要来自2和9号色谱峰；第4主成分信息主要来自7号色谱峰；第5主成分信息主要来自1号峰。用SPSS 19.0进行因子分析时，得到的是因子载荷矩阵，未经过旋转，计算主成分得分时，需要用未旋转的因子载荷矩阵的系数除以对应成份特征根的平方根作为指标的系数权重，即特征向量。特征向量由因子载荷矩阵以及特征值λ计算而来，即i＝i/i1/2，求得特征向量（表5）。

表3 木豆叶主成分分析特征值和方差贡献率

表4 因子载荷矩阵

以1、2、3、4、5代表5个主成分作为13个品种木豆样品成分所表达的信息，以标准化的共有峰峰面积（A1～A13）为变量，建立起品质评价模型，计算其综合得分。1＝0.2091－0.2662＋0.1203－0.3724＋0.1995－0.3646＋0.1397＋0.3648＋0.2169＋0.33510＋0.09911＋0.32112＋0.36913；2＝0.1991－0.2572＋0.3423＋0.2884－0.3885＋0.2616－0.1497＋0.1418－0.3079＋0.35910－0.46811＋0.10812＋0.12213；3＝0.1471＋0.4052＋0.1453＋0.1884－0.4055＋0.2656＋0.1437－0.1768＋0.3719－0.03510＋0.34711＋0.33312＋0.31813；4＝0.1081＋0.2202＋0.1363－0.1134＋0.2395＋0.1056＋0.7707－0.2208－0.4199＋0.10210－0.11211－0.00212＋0.02413；5＝0.6721－0.0342＋0.2443＋0.1244＋0.0285＋0.0336＋0.0847＋0.2578－0.1369－0.07210＋0.27511－0.41712－0.35413；综合得分＝（34.327%1＋18.335%2＋15.253%3＋10.049%4＋8.649%5）/86.614%，结果见表6。S8、S12和S9得分最高。为进一步分析13个品种木豆样品间的组间差距，将木豆样品中11个共有峰的峰面积导入SIMCA 13.0软件绘制PCA得分图，见图4。13个品种木豆被分为5类，与HCA结果基本一致，样品之间的离散程度较大，表明样品差异性较大。

表5 成分的特征向量

表6 木豆叶主成分得分及排名

图4 13个木豆叶品种的PCA得分图

3.5 最小二乘判别分析 (partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)

在PCA分析提取得到5个主成分的基础上，建立有监督模式PLS-DA模型。PLS-DA得分图如图5所示，13个木豆品种分成5组，该结果与PCA结果一致，说明不同品种的木豆化学成分均存在差异。根据变量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）图（图6）可知，VIP＞1的色谱峰有7、10、6、9、11号峰，说明不同品种木豆叶的化学成分主要是由上述成分引起的。

3.6 不同品种木豆叶中主成分含量比较

图5 13个木豆叶样品PLS-DA得分图

图6 13个木豆叶样品VIP值图

表7 样品含量测定结果(n = 3)

4 讨论

不同品种的木豆叶所具有的化学成分各有差异，进而影响其药效，因此有必要建立一种可靠的木豆叶质量控制方法。本实验采用二极管阵列检测器检测，以峰数和分离度为指标，将样品在286～335 nm波长下进行扫描，分别考察了254、286、335 nm波长下的色谱峰，结果286 nm下的色谱峰分离效果最好，因此确定286 nm作为检测波长。依据此色谱方法建立起木豆叶的指纹图谱，发现13个品种木豆叶的相似度均在0.9以上，说明这些木豆叶中化学成分的种类相差不大，但在含量上存在一定差异。

随着人们对中药需求量的增大以及用药安全意识的加强，中药质量控制越显重要。指纹图谱作为中药质量评价的模式，可用于评价药材的一致性和稳定性，以其科学的理论依据获得了国际上的一致认可[20]。指纹图谱在色谱峰未明确为何种成分的情况下，仍能给出充分、可靠的信息，用以控制中药材质量[21]。本研究所建立的RP-HPLC-DAD指纹图谱、HCA、PCA以及PLS-DA的结果不仅可以为木豆叶的质量评价提供科学的方法，也为其药效物质基础研究奠定了基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality evaluation of differentleaves based on RP-HPLC-DAD fingerprint combined with chemometrics and determination of main components

FU Li-na, WANG Li-tao, WANG Jian-dong, WANG Yan-qiu, CAI Zi-hui, YAN Xin-yu, ZHAO Peng-quan, ZHANG Su, FU Yu-jie

College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

To evaluate the commonality and difference ofleaves based on RP-HPLC-DAD fingerprints combined with chemometric methods, providing a scientific basis for the quality evaluation ofleaves.The RP-HPLC-DAD fingerprints of 13 different species ofleaves were established by RP-HPLC-DAD. The quality ofleaves. was evaluated by similarity analysis (SA), hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and partial least square discriminant analysis (PLS-DA) and six main components in the sample were determined by RP-HPLC-DAD.The HPLC fingerprint ofleaves was calibrated with 13 common peaks, and the similarity of them were all above 0.90. These 13 species ofleaves were divided into five categories by HCA. The results of PCA and HCA were basically consistent. According to PCA, S8 had the highest comprehensive score and the best quality, followed by S9 and S12. The results of PLS-DA and PCA were basically consistent. The differences in composition ofleaves were mainly caused by chromatographic peaks 7, 10, 6, 9, and 11. The content of S8, S9 and S12 were among the top 3, which was consistent with the comprehensive score of PCA.Fingerprint combined with HCA, PCA and PLS-DA can comprehensively evaluate the quality ofleaves and provide a comprehensive reference for quality control ofleaves.

leaves of(L.) Millsp; fingerprint; chemometrics; cluster analysis; principal component analysis; partial least square discriminant analysis; orientin; isovitexin; vitexin; luteoloside;quality evaluation

R286.2

A

0253 - 2670(2022)24 - 7880 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.025

2022-03-30

国家自然科学基金重点项目（31930076）；通络生骨胶囊品质提升研究（2020HXFWLXY001）

符丽娜（1997—），女，硕士，研究方向为森林植物资源开发与利用。Tel: 13121888511 E-mail: 1315136640@qq.com

付玉杰，博士生导师，教授，从事森林资源活性成分提取分离与产业化开发。Tel: (010)62926233 E-mail: yujie_fu@163.com

[责任编辑 时圣明]