提升干细胞在骨科疾病治疗中的应用效果研究进展

陈紫航 郑小飞 王华军

暨南大学附属第一医院骨关节与运动医学中心（广州 510000）

引言

干细胞作为一种未完全分化的原始细胞，理论上具有分化成其他各种细胞的潜力。近些年来，干细胞的深入研究，为过去许多无法完全再生的骨科相关疾病带来了新的曙光。例如，被称为“不死癌症”的骨关节炎（osteoarthritis，OA），严重影响患者的生活质量和身心健康。OA 的发病率和致残率都很高，全世界有2.5 亿患者受到影响[1]。不幸的是，目前临床上常用的治疗技术不能再生关节软骨。干细胞再生医学，被认为是最有希望再生关节软骨的方法之一[2]。此外，肩袖和前交叉韧带损伤，也是目前骨科中非常常见且严重的疾病。手术重建是治疗这类损伤的关键方法，但在愈合过程中往往是以疤痕愈合为主，使其传递负荷及减少应力集中的能力大大减弱，术后容易出现再撕裂[3]。有研究发现，干细胞有促进肌腱愈合的作用[4]。虽然，干细胞修复具有非常美好的前景。但是，干细胞在临床上的应用还存在一些问题，例如，干细胞的来源不足、移植后干细胞存活率不高、修复效果不理想以及免疫排斥等。本文综述提升干细胞在骨科疾病治疗中应用效果的最新策略和研究进展，以期更好地整合各种策略，指导干细胞在骨科疾病中的应用，为提高骨科疾病的临床预后提供一定的理论依据。

1 干细胞修复骨科疾病的四大基础策略

1.1 基础策略一：内源新干细胞的归巢

早在十年前，就有学者发现在肩袖损伤修复手术后骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以自主钻出肱骨的修复孔道，帮助术后肩袖的愈合[5]。后来随着研究的深入，人们发现，这是一种干细胞的归巢现象。“归巢现象”最早是由Gallatin 等[6]提出的，它最初被用来描述循环血液中的淋巴细胞倾向于迁移到它们最初起源的地方的现象。如今，“归巢”被用来强调干细胞对迁移刺激和信号引导等细胞外信号做出反应的能力，这促进了干细胞有针对性的运输和迁移[7]。大多数组织在受到损伤或发生炎症时都会在一定程度上启动募集干细胞，进而促进干细胞归巢到受损区域发挥各种修复作用[8]。由于内源性干细胞不需要在体外培养和扩增，并且没有免疫原性和疾病传播的风险，与外源性干细胞相比具有独特的优势，备受研究人员青睐。然而，在临床应用过程中低效的归巢是干细胞治疗最主要的限制。为了提高干细胞归巢效率，在骨科疾病的干细胞治疗应用中，研究人员运用了以下策略：

1.1.1 微骨折手术

透明关节软骨的愈合能力有限，部分原因是关节表面层缺乏内在的血液供应、有丝分裂活性和祖细胞募集不足。微骨折（microfracture，MF）是最常用的骨外科手术，它可触发内源性间充质干细胞（mesenchy⁃mal stem cells，MSCs）从骨髓迁移到受伤区域以再生软骨组织[9]。Min 等[10]发现空心锥体引起的MF 通道比传统的钝锥引起的MF通道更通畅，并且可以动员更多的BMSCs 到软骨缺损的位置。MF 已成为膝关节软骨缺损手术中既定的治疗选择[11]。在肩袖损伤的治疗中，MF 也被广泛使用，并进一步提出纳米骨折（nano⁃fracture，NF）概念，NF意味着产生更小直径的穿孔。在关节镜下进行肩袖损伤修复手术过程中，使用纳米压裂套管针对肱骨头软骨下骨穿孔并深入松质骨，可以在减少对其软骨下板损伤的基础上增加骨表面BMSCs的数量[12]。大多数临床试验结果表明MF 的短期预后良好。然而，由于修复凝块的耐久性较差，并且在典型的纤维软骨修复中缺乏Ⅱ型软骨，其疗效尚不确定[13]。

1.1.2 增加趋化因子浓度

基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）/CXC 趋化因子受体4（CXC chemokine re⁃ceptor type 4，CXCR4）信号通路已被证明在内源性干细胞归巢中起关键作用[14]。Zhang等[15]使用含有SDF-1的Ⅰ型胶原支架成功修复了兔膝关节软骨缺损，并证实增加损伤部位趋化因子的浓度可促进内源性干细胞归巢并介导软骨再生。在另一项研究中，研究人员将转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）植入光交联甲基丙烯酸酯修饰的羟丙基甲壳素水凝 胶（glycidyl methacrylate- modified hydroxypropyl chitin hydrogel，GM-hPCH）中，以修复大鼠的关节软骨缺损。结果表明，与GM-hPCH 单独应用相比，GMhPCH-TGF-β1 可通过其募集干细胞的能力更有效地修复软骨缺损[16]。在类似的研究中，白细胞介素8和巨噬细胞炎性蛋白3α也被证实可以促进干细胞归巢到关节软骨损伤部位，并介导关节软骨再生[17]。虽然与生物因子缓释支架的联合应用可有一定效果，但是长时间持续稳定在体内释放生物趋化因子诱导干细胞归巢的方案和技术仍然不够成熟。

1.2 基础策略二：外源性干细胞预处理

干细胞再生修复组织是一个异常复杂的过程。在使用干细胞进行组织再生过程中常会遇到一些问题，包括细胞活力低、分化差、细胞间通讯无效、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成差和迁移缓慢等[18，19]。由于氧化应激、酸中毒、缺氧、炎症以及缺乏营养等使受伤区域的微环境变化，会阻止干细胞有效地参与再生过程。为了克服这些缺点，研究人员采用施加类似于细胞在损伤区域所面临的“不利环境”对干细胞进行“预处理”。“干细胞预处理”过程中的诱导环境可能会在最初阶段损伤干细胞，因此预处理又被称为“损伤诱导保护”[20]。损伤组织中的环境应激降低了移植干细胞的活力、分泌功能、分化和迁移能力。但是，干细胞预处理能够改善干细胞的血管生成诱导、增殖、存活、免疫调节以及向损伤区域迁移的能力[19]。在干细胞治疗骨科疾病领域，研究者们主要进行了以下尝试：

1.2.1 缺氧预处理

缺氧是干细胞移植失败和移植细胞死亡的主要原因之一。低氧应激增加缺氧诱导因子-1α（hypoxia-in⁃ducible factor-1α，HIF-1α）的表达可以激活一些下游靶点和信号分子，它们在细胞迁移、存活、葡萄糖调节、新生血管、分化和增殖中起关键作用。例如，HIF-1α可以诱导聚集蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，Col-2）和SRY 盒转录因子9（SRYrelated HMG box-9，SOX-9）等成软骨基因表达，促进干细胞向软骨细胞增殖和分化，修复损伤软骨[21]。Ar⁃chacka 等[22]发现，骨髓来源的MSCs 进行缺氧预处理增加了SDF-1 和血管 内皮 生长 因子（vascular en⁃dothelial growth factor，VEGF）的表达，可以更加有效地改善肌生成和促进血管生成，这在骨骼肌再生中起重要作用。在干细胞治疗股骨头坏死方面，缺氧预处理的MSCs 具有更高的治疗效益，缺氧预处理后的MSCs可分泌更多的生物因子，如VEGF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bF⁃GF），有更强的血管生成和成骨诱导作用[23]。

1.2.2 化学制剂或药物预处理

对干细胞预先模拟体内环境或者制造一些“艰难”的条件，可以诱导干细胞的“损伤诱导保护”。有研究报告称，脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）预处理的间充质干细胞改善了再生和修复的特性，显著促进了软骨细胞的增殖和迁移，并抑制了软骨细胞的凋亡[24]。研究表明p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-acti⁃vated protein kinase，MAPK）抑制剂（sb203580）对脱细胞细胞外基质（decellularized extracellular matrix，dECM）介导的干细胞软骨再生具有独特的启动作用。sb203580 预处理后会使炎症环境中dECM 扩增，促进人类滑膜衍生干细胞（human synovial derived stem cells，hSDSC）进行软骨再生[25]。锂是一种常见的抗抑郁药物，Zhu 等[26]利用氯化锂（LiCl）预处理大鼠脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchy⁃mal stromal cells，ADSC）用于治疗大鼠椎间盘退变疾病模型，发现预处理后的大鼠ADSC显示出更强的增殖能力和更高的髓核细胞分化能力，能更好地治疗大鼠的椎间盘退行性变。

1.2.3 细胞因子预处理

生物细胞因子和介质在炎症、增殖、分化和再生等生理和病理生理过程中起着至关重要的作用，几乎所有存在于体内的生物细胞因子都会影响移植细胞的再生能力。因此，它们也常常被当作干细胞预处理诱导剂。为了模拟骨损伤后的急性炎症阶段，Lu 等[27]用肿瘤坏死因子-α预处理MSCs，结果增强了其增殖和分化能力，并提高了骨再生效率。白细胞介素家族在提高多种干细胞的活性、增殖和分化方面的作用已为人所知。有报道称白细胞介素3（interleukin-3，IL-3）预处理可促进MSCs 上调CXCR4 表达，增加干细胞的迁移和向成骨细胞分化的能力[28]。对干细胞附着生存环境进行生物因子预处理也有一定效果。钛合金植入物周围充分的骨形成是植入手术成功的必要条件，Hong等[29]发现对钛合金表面进行富血小板血浆（plateletrich plasma，PRP）预处理可以显著促进人脂肪干细胞（human adipose derived stromal cells，hADSCs）向其表面增殖和成骨分化，有利于种植体周围骨形成。

1.2.4 物理因素预处理

机械刺激如循环静水压力、动态压缩和声波可以诱导干细胞分化为软骨细胞，因为它们建立了软骨分化所需的生物力学刺激。声波也可以作为预处理诱导剂。低强度超声波预处理BMSCs 可上调SOX-9、ACAN 和金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2）的表达，从而提高软骨分化能力[30]。此外，机械拉伸可能会损伤移植的细胞，导致细胞死亡。因此，机械拉伸也可用于细胞预处理。有研究表明，由10%拉伸、30次/min循环拉伸组成的机械拉伸预处理可激活核转录因子-κB（nuclear fac⁃tor-κB，NF-κB）进而促进VEGF-A的生成，增加血管生成能力，降低细胞凋亡率[31]。

1.2.5 基因编辑

干细胞增殖和分化是非常复杂的的过程，受到各种微环境中基因的调节。对其中不利于干细胞成骨/成软骨分化的基因进行敲除或者沉默其表达，对有利于干细胞成骨/成软骨分化的基因进行转入，成为干细胞再生医学领域一种新的研究思路。据报道，在小鼠糖尿病性骨质疏松症（diabetic osteoporosis，DOP）模型中，miR-493-5p敲低可以通过miR-493-5p/ZEB2轴减轻DOP 状况，促进BMSCs 成骨分化[32]。敲除人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，hM⁃SCs）的miR-579-3P 可以增加成骨相关基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨特异性转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）的表达，增强ALP的活性和矿化形成的能力[33]。白细胞衍生的趋化因子2（leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2）通过介导下游靶基因β-catenin 成为肝炎等一些慢性疾病的调节因子。LECT2 的敲低会激活Wnt/β-catenin 通路，从而促进MSCs 中的成骨分化，为骨质疏松症的诊断和治疗提供一种新的策略方案[34]。为了促使干细胞稳定进行成骨分化，Chen 等[35]分别将重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenet⁃ic protein-2，rhBMP-2）和重组人血管内皮生长因子（recombinant human vascular endothelial growth fac⁃tor，rhVEGF）质粒转染到小型猪中分离出的ADSC上，用于骨缺损修复，结果发现转染后的ADSC 可释放rh⁃BMP-2或rhVEGF至少4周，并且可以显著促进骨缺损的修复。

虽然外源性干细胞的预处理方案有很多且都能达到一定的预期效果，但由于临床上干细胞的捐献、管理和安全屏障仍然不足，所以大多数研究还只是停留在动物实验阶段。此外，进行“损伤诱导保护”预处理势必会造成更多干细胞死亡，在干细胞来源如此有限的现状下，如何把握干细胞“数量”与“质量”之间的平衡，仍未解决。再者，对于干细胞进行基因编辑仍面临着伦理、免疫排斥、癌变等风险。以上原因在一定程度上限制了外源性干细胞的临床应用。

1.3 基础策略三：干细胞衍生物的应用

越来越多的研究发现，基于干细胞的治疗效果主要归因于其旁分泌[36]。干细胞通过旁分泌向体内传递一系列信号物质，包括生长因子、细胞因子和胞外囊泡。其中，BMSCs 衍生的外囊泡（mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles，MSC-EVs）作为细胞间信息传递的重要媒介，参与了许多生物学和病理过程[37]。MSC-EVs 已被证明具有与MSCs 相似的功能且作为非细胞成分更有优势[38]。此外，干细胞来源的细胞外基质（MSC-ECM）同样是一种含有各种干细胞分泌大分子的非细胞成分，在去除了如DNA 等触发免疫反应的细胞成分后，细胞外基质保留了自然的生化和生物物理信号[39]。作为无细胞治疗方法，MSC-EVs 和MSC-ECM在骨关节炎、软骨损伤修复等骨科疾病治疗领域日益受到再生医学和组织工程学者的关注。

1.3.1 MSC-EVs在骨科疾病治疗中的应用

根据国际细胞外囊泡协会（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）的标准和声明，细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）根据其大小和生物发生机制通常可分为三种亚型：外泌体（exosomes，EXOs）、微囊泡和凋亡小体[40]。MSC-EVs 在肌腱损伤、软骨退变、椎间盘退变、骨折和骨质疏松等骨科相关性疾病中被大量研究。近些年来，越来越多的研究表明，EVs是MSCs在组织修复过程中分泌的主要治疗成分，可增强MSCs 的再生和免疫调节能力[38]。EXOs 可以通过MAPK 信号通路促进成骨细胞系的存活、增殖和分化，从而改善和预防骨质疏松[41]。在软骨损伤修复方面，MSC-EVs 可以刺激细胞增殖、增加细胞外基质合成，以及减少促炎细胞、调节免疫微环境，为软骨组织修复和再生创造条件[42]。在肌腱损伤修复方面，MSCEVs 同样具有巨大的潜力。有证据表明，MSC-EVs 可以抑制肌腱干细胞的凋亡，刺激其增殖、迁移和成腱分化[43]。

1.3.2 MSC-ECM在骨科疾病治疗中的应用

MSC-ECM 含有大量的天然干细胞分泌出的细胞因子，是一种天然生物材料，具有很好的生物活性和生物相容性。大量研究表明，MSC-ECM可以增强细胞增殖，防止软骨细胞去分化，并维持干细胞的特性[44]。Yang 等研究表明，与生长在聚苯乙烯塑料培养皿上的软骨细胞相比，接种在人BMSC-ECM 上的软骨细胞具有更明显的增殖效果，并保持了更好的软骨表型[45]。肌腱干/祖细胞（termed tendon stem/progenitor cells，TPSCs）的命运已被发现主要由ECM蛋白调控，细胞外基质成分的改变解释了TPSCs从肌腱形成到成骨或软骨形成的转变[46]，因此，ECM 在肌腱组织骨-腱连接位点的修复中具有重要作用。BMSC-ECM中的双糖链蛋白聚糖（biglycan，BGN）和纤维调节蛋白（fibromodu⁃lin，FMOD）可通过调节骨形态发生蛋白（bone morpho⁃genetic protein，BMP）信号传导和损害体内肌腱形成来影响TSPC 的分化[46]。

干细胞的衍生物作为非细胞成分，由于其独特的生物学特征，在癌症和组织再生的众多领域引起了越来越多的关注。但是，低分离率和靶向能力不足在某种程度上限制了它们的治疗适用性[47]。

1.4 基础策略四：干细胞与生物工程支架结合

干细胞治疗是一种很有前途的骨组织再生工具。然而，追踪并在损伤部位限制、维护它们是非常困难的。一个潜在的解决方案是将细胞种植到生物相容的支架上。人体细胞在体内复杂的三维微环境中生长，它允许不同细胞类型之间、细胞与细胞外基质之间相互作用，而组织工程支架可以充当细胞外基质，支持细胞增殖、粘附、分化、扩散和交流，让细胞顺利生长。骨工程支架能够将骨干细胞招募到骨折部位，并诱导其成骨分化。合适的支架孔隙尺寸可为蛋白质提供吸附位置，并改善细胞的黏附、增殖和分化，支架孔隙率选用骨小梁的孔隙度可以模拟骨小梁的孔隙，进而促进骨再生[48]。在钙-磷（Ca-P）陶瓷材料中，羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）和磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）因其成分与天然骨相似，显示出高度生物相容性和骨传导性，并具有较高的骨折部位骨再生整合能力[49]。然而，Ca-P 陶瓷材料存在机械稳定性不足的缺点。此外，生物可降解材料也备受骨修复支架材料的青睐。研究表明，聚乳酸（poly lactic acid，PLA）具有良好的生物相容性、可塑性、生物降解性以及支持骨干细胞黏附和生长的能力，是一种有效的骨修复材料[50]。与PLA 相似的生物合成材料还有聚乙醇酸（poly glycolic acid，PGA）、聚乳酸-乙醇酸共聚物（poly lac⁃tic-co-glycolic acid，PLGA）和聚己内酯（polycaprolac⁃tone，PCL）。其中，因PCL 显示出更好的机械性能，所以PCL 被认为是最适合的骨组织工程生物材料[49，51]。虽然聚合物支架已经在骨组织工程中得到了广泛应用，但同样也存在一些缺点，如力学性能差、易变形、与骨的结合力差等。因此，有研究者将陶瓷材料和生物可降解材料融合，将两者的优点结合起来，形成复合生物材料。复合生物材料支架同时具有这两种类型的优点，如提高了生物相容性和生物活性、机械韧性、宿主-植入物相互作用和承载能力。有效的复合生物材料的例子包括PLGA 和PCL 与TCP 或HA 结合。它们不仅具有陶瓷材料的高生物活性潜力，而且同时具有聚合物降解的可控性。此外，它们还可以在强度和韧性之间保持适当的平衡[52]。近些年来，生物相容性材料以及带有活细胞的复杂3D 骨支架产品受到欢迎。这些细胞是通过生物打印技术创造出来的，能够模拟其天然组织类似物的生物学功能。例如，Saberi等[53]使用三维生物打印技术构建了一种由聚乳酸和喷雾干燥的玻璃陶瓷微粒（spray dried glass-ceramic microparticles，SGCMs）组成的三维复合支架，该支架不仅具有明确的互连孔隙率和良好的机械性能，且具有更好的生物矿化能力。hMSCs 附着实验表明，SGCMs 改善了hM⁃SCs粘附和活力以及ALP 活性，这是促进成骨分化的重要特征。

生物工程支架技术在巨大骨缺损修复领域的应用已经十分广泛[54]。干细胞与组织工程的最终目标是实现组织的完美修复并避免细胞扩增及其相关并发症。虽然临床研究仍处于起步阶段，但干细胞与新型支架材料一起为OA 患者提供了有希望的治疗选择。此外，细菌感染很可能会发生在外科手术或生物支架上，在不损害其性能的情况下完成较强抗菌能力的支架设计和制备也是一项挑战。

2 联合应用

虽然对于干细胞的处理策略非常多，但是单独的处理都未能达到十分满意的修复效果。采取多种策略进行联合干预，理论上应该能达到更好的修复效果。例如，Lu 等[55]就在兔膝关节全层软骨缺损模型上，联合MF手术，使用水凝胶生物支架附着干细胞、dECM及添加骨髓归巢肽等多项策略，结果显示，与单独处理相比，复合策略组的内源性干细胞归巢显著增强、关节软骨缺损处被软骨样组织完全覆盖，表面光滑，与周围的天然软骨相似，软骨修复质量显著提高。相似的实验结果也在大鼠膝关节软骨损伤模型中被证实。研究人员在PCL 静电纺丝网状支架上共价结合对BMSCs 具有高度特异性亲和力的氨基酸小分子E7，并联合MF手术增加内源性干细胞归巢，结果显示，复合策略组显著增强了MSCs 在体内募集和软骨修复效果[56]。类似的研究还有不少，但是总体而言，大多数都还停留在动物实验，相关临床研究还处于起步阶段，例如，Kaigler团队对局部颅面骨缺损进行干细胞修复临床研究，通过对比“β-磷酸三钙支架+自体干细胞组”和“单纯接受β-磷酸三钙支架组”，发现与非干细胞治疗患者相比，接受干细胞治疗的患者骨的密度更高，产生了更好的骨质量[57]。

虽然干细胞修复骨组织是非常有前景的生物修复策略，但是鉴于安全性、可获取性和伦理审查等条件，在骨科领域的干细胞修复研究依然没有大规模展开。干细胞的联合处理也仅应用于基础研究。因为干细胞一旦植入就不可逆，将持续存在于患者体内。而干细胞的自我复制和分化又难以预测及控制。所以，干细胞修复将不可避免地伴有结果的复杂性，例如肿瘤或异常组织的形成等。

3 小结

在骨科相关疾病中，干细胞治疗是一种很有前景的治疗方法，但在临床应用中仍然存在一些盲点和障碍。增强内源性干细胞归巢到受损部位、对移植的干细胞进行预处理、干细胞衍生物的合理利用以及运用骨组织生物工程支架等策略都可以有效地改善干细胞对骨、软骨和肌腱等组织损伤的修复效果，但距离完美的组织修复还有一定的差距。各种策略仍然具有很大的潜力待研究开发。例如，在干细胞归巢方面，新型趋化细胞因子的发现以及微调控可以促进干细胞归巢；在干细胞预处理方面，新的预处理诱导剂和预处理方案的研究，联合两种或两种以上的诱导剂进行预处理等都有望加强预处理的预期效果；在干细胞衍生物方面，研究清楚外泌体的作用机制，以及关节注射后生物分布情况，提高提取率和靶向率等；在细胞工程支架方面，随着生物材料工程学的发展，必然会出现更多更优质和理想的生物材料，对生物材料的降解实现时间和空间的调控，以及更加精准地模拟人体内骨组织细胞修复的过程等。值得一提的是，以上各种策略方案之间并不是独立存在的，各种策略方案之间的相互联合，理论上可以更加有效地发挥干细胞的修复功能。相信在不久的将来，干细胞的应用将大大提高骨科相关疾病的临床治疗效果，更好地造福有需要的患者。