蛇床子中总黄酮最佳提取工艺优化及杀虫抑菌活性研究

吴永玲，魏 景，孟银凤，李俊伟

（1.商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2.陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000）

蛇床子［Cnidium monnieri（L.）Cuss.］为伞形科植物蛇床成熟后的干燥果实，主要分布于中国华东、中南、西南、西北等地［1］。现代研究表明，蛇床子中含有多种活性成分，其中以蛇床子素、香豆素及黄酮类成分为主，具有杀虫抑菌、止痒、抗心律失常、抗血栓、抗肿瘤和骨质疏松等药理作用，成为国际上天然药物开发利用的热点［2，3］。但目前蛇床子中的主要成分及药理研究集中在蛇床子素上［4-6］，对其中的黄酮类化合物研究报道较少。如果能进一步开发利用蛇床子中的黄酮类物质，这对蛇床子植物的发展将具有一定现实意义。

同时，近些年农作物病虫害的防治主要依靠化学农药，产生严重的农药残留及抗药性问题［7，8］，而市场上商品化的生物源农药往往只具备一种农用活性，给病虫害混合发生的药剂施用带来诸多不便。开发兼具杀虫抑菌活性的生物源农药已成为开发绿色、安全、便捷食品的必要措施［9］。

天然产物中有效成分的提取方法多为超声辅助提取［10］、膜分离提取等［11］，并结合正交设计或响应面设计试验进行优化［12］。响应面设计在工艺优化与混料设计上应用广泛，具有试验操作简洁、模型选择广、预测精度高等特点［13，14］。因此，本研究采取传统的乙醇浸提法，结合提取单因素分析及响应面试验优化，以期开发出提取率高、经济成本低的蛇床子总黄酮最佳提取工艺，同时对提取物的杀虫和抑菌活性进行研究，为蛇床子植物和生物源农药的深层次开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料供试样品：蛇床子果实（购自商洛市中药材商店），试验前烘干后粉碎备用。

主要试剂：乙醇（分析纯）、芦丁标准品、NaOH（分析纯），上海阿拉丁试剂公司。

供试昆虫：苹果黄蚜（Hyalopterus amygdali）、朱砂叶螨（Tetranychina harti）分别采集于商洛学院苹果树和玉米叶上，经商洛学院生物学院孟银凤博士鉴定为苹果黄蚜、朱砂叶螨。

供试菌种：甘蓝黑斑病菌（Broccoli and Purple cabbage bacterial leaf spot）、苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioidesPenz）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、苹果腐烂病菌（Cytosporasp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearumSchw）及水稻纹枯病菌（Thanatephorus cucumeris）均来源于西北农林科技大学无公害农药研究服务中心。

1.1.2 主要仪器BJ-300型粉碎机（广州旭朗机械设备有限公司），S-114型电子天平（上海精科实业有限公司），SHB-IIIA型循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司），RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），UV-765B型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海双旭电子有限公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司），YXQ-LS-18SI型高压灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司），LRH-70F型生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蛇床子总黄酮的提取精密称取10 g烘干粉碎后的蛇床子，用无水乙醇浸泡，采用浸提法得到提取液，过滤，取上清液，得到蛇床子提取液。

1.2.2 对照品溶液的配制精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品20 mg于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度线，即得0.2 mg∕mL芦丁对照品溶液［15］。

1.2.3 标准曲线的绘制量取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加水至5 mL，加入5% NaNO2溶液1.0 mL，混匀后放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，再加入4% NaOH溶液10.0 mL，加水至刻度线，摇匀，放置15 min。以第一组试剂作为空白对照，在波长510 nm处，分别测定系列浓度溶液的吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.4 总黄酮得率的测定采用硝酸铝显色法测定蛇床子总黄酮类物质的含量，利用紫外可见分光光度计测定提取液在波长510 nm处的吸光度。

1.2.5 单因素试验每组精密称取10 g蛇床子，以黄酮得率作为评价指标，采取单因素法研究不同溶剂体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、提取时间（15、20、25、30、35 min）、提取温度（40、50、60、70、80℃）和乙醇体积（50、75、100、125、150 mL）4个因素对黄酮提取率的影响，研究其中一个因素的影响时其他因素作为基础水平。以单因素为横坐标，提取率为纵坐标，绘出每个因素对蛇床子总黄酮得率的影响折线图。

1.2.6 响应面优化试验综合单因素试验结果，每组精密称取5 g蛇床子，采用Box-Behnken因素设计试验，以蛇床子总黄酮提取率为评价指标，选取影响黄酮提取率较显著的因素，优化蛇床子黄酮类物质提取工艺条件（表1）。采用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行数据分析。

表1 Box-Behnken设计因素及水平

1.2.7 杀虫活性测定试验采用梯度稀释法，将蛇床子提取物分别稀释为100.0、10.0、1.0 mg∕mL的供试药剂进行杀虫活性测定。

1）对苹果黄蚜的毒杀活性测定［16］

采用浸虫浸叶法：将带有苹果黄蚜的苹果叶片采下，挑选大小基本一致、健康的无翅成蚜作为试虫，用毛笔剔除不合格虫体，每片叶上至少保留30只蚜虫，将带有试虫的叶片在配好的药液中浸渍3～5 s取出，滤纸吸干虫体及叶片周围的多余药液，处理后的叶片置于9 cm培养皿中，培养皿中预先铺上滤纸保湿，每处理重复3次，每次重复30头试虫。滴水保湿，24 h后检查试虫死亡数（毛笔轻触虫体，不动即视为死亡），以0.5%表面活性剂（吐温-80）水溶液作为空白对照，计算死亡率以及校正死亡率。计算公式如下所示。

2）对朱砂叶螨的毒杀活性测定［17］

采用玻片浸渍法：先将双面胶一面贴在洁净的载玻片上1∕3处，用毛笔挑取活动力强、个头一致的成螨，使其背部粘于贴有双面胶的载玻片上。粘贴时要注意使虫体肢体朝上、背部粘胶，螨足可自由活动。每玻片粘朱砂螨40头，2 h后镜检观察，剔除不合格虫体，每玻片至少保留30头。将粘有朱砂叶螨的载玻片浸入供试药剂中3～5 s后取出，滤纸吸去玻片周围多余药液，以0.5%表面活性剂（吐温-80）水溶液作为空白对照，每处理重复3次，24 h后检查并统计死虫数，计算死亡率和校正死亡率。

采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，用Duncan's新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析，并计算蛇床子提取物对2种试虫的毒力回归方程、致死中浓度（LC50）及95%置信区间。

1.2.8 抑菌活性测定试验蛇床子总黄酮提取液对7种植物病原菌的抑制率和EC50采用生长速率法进行测定［18，19］。配制浓度为10 000 μg∕mL的蛇床子总黄酮母液，取1 mL母液加入100 mL的PDA培养基中混合均匀即制成100 mg∕L含药培养基，然后分别将菌饼接种到含药培养基上，重复3次，设置空白对照，置于26℃培养箱中培养72 h，测得供试菌的生长直径，计算抑菌率。根据抑菌率的结果选择合适的浓度进行倍半稀释，配制系列浓度含药溶液，再采用生长速率法对7种病原菌进行抑菌率测定，求出毒力回归方程，并计算EC50。抑菌率计算公式如下所示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

所得标准曲线方程y=2.251x+0.001 6。因R2=0.992 1接近1，表明芦丁浓度与吸光度二者之间线性关系良好。

2.2 单因素试验考察结果

单因素试验中各因素对蛇床子总黄酮得率的影响见图1。

2.2.1 溶剂浓度对蛇床子中黄酮类物质提取率的影响由图1a可知，总黄酮得率在乙醇体积分数为50%～60%时增加较快，最大值为9.22%。当乙醇体积分数大于60%后总黄酮类物质的得率逐渐下降，这可能与脂溶性物质溶解量有关。因此，可以确定60%为超声提取蛇床子总黄酮的最佳溶剂体积分数。

图1 单因素试验中各因素对蛇床子总黄酮得率的影响

2.2.2 提取时间对蛇床子中黄酮类物质提取率的影响由图1b所示，在提取时间为15～25 min时黄酮提取率呈上升趋势，黄酮得率最大为13.56%。25 min后总黄酮得率逐渐下降，这可能是因为超声时间越长，蛇床子和乙醇溶液接触越充分以致总黄酮类化合物溶出较多，已溶出的黄酮类物质可能会随其他大分子溶出或降解，故蛇床子总黄酮类物质的最佳提取时间为25 min。

2.2.3 提取温度对蛇床子中黄酮类物质提取率的影响由图1c所示，提取温度为40～60℃时，蛇床子总黄酮的得率逐渐增大，且黄酮得率最大为6.64%。当温度高于60℃时开始下降，这可能与蛇床子中黄酮类物质的结构随温度升高而破坏有关，故蛇床子总黄酮最佳提取温度应为60℃。

2.2.4 溶剂体积对蛇床子中黄酮类物质提取率的影响由图1d所示，在溶剂体积为50～100 mL时黄酮提取率呈上升趋势，黄酮得率最大为23.88%。溶剂体积大于100 mL后黄酮得率逐渐下降，这可能是因为溶剂体积越大时，溶液与之接触越充分，导致其他大分子物质溶出，使黄酮类物质提取率降低，故蛇床子总黄酮类物质的最佳提取溶剂体积为100 mL。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 回归模型的建立及方差分析综合单因素试验结果，选择Design-Expert V 8.0.6.1执行Box-Behnken中心组合设计模型，固定提取温度为60℃，以蛇床子黄酮得率（Y）与溶剂体积分数（A）、提取时间（B）、溶剂体积（C）建立回归模型，对表2中响应面试验结果进行多次回归拟合，得到回归方程：Y=7.72-1.09A+0.29B-1.72C-0.22AB+0.81AC+0.65BC-2.29A2-1.84B2-1.23C2。

表2 蛇床子黄酮提取率响应面试验设计

由表3所示，模型达到极显著水平（回归模型P＜0.000 1），同时方程失拟项P=0.115 5，表明模型选择可靠、预测值与实际值相差不大，故可用此模型分析和预测影响蛇床子中黄酮提取率的3个因素变化规律。从模型显著水平可以得出，蛇床子黄酮提取率的影响因素为：C（溶剂体积）＞A（溶剂体积分数）＞B（提取时间），表明这3个因素均与蛇床子黄酮提取率有一定相关性，其中溶剂体积对蛇床子黄酮提取率的影响极显著。

表3 回归模型的方差分析

将模型中A、B和C3个因素在方差分析的基础上固定在中间水平上，蛇床子黄酮的得率作为响应指标［20］，得出其他2个因素交互作用蛇床子黄酮提取模型，并根据该模型绘制3D图。等高线弯曲程度则反映了2因素之间的交互作用大小［21］，如图2所示，溶剂体积分数与溶剂体积、溶剂浓度与提取时间两两交互作用对提取率的影响较大，而溶剂体积与提取时间作用并不明显。在3D图中的最高点可以得到一个理论最大值，这与方差分析结果一致。

图2 2因素相互作用影响蛇床子总黄酮得率的响应面效果

2.3.2 最佳工艺条件的确定及验证按照蛇床子总黄酮响应面法的试验结果，得到最佳提取条件下总黄酮得率预测值为7.716%，即溶剂体积分数为63.78%，提取时间为23 min，溶剂体积为84.44 mL。考虑实际可操作性，将最优提取条件调整为溶剂体积分数64%、提取时间23 min、溶剂体积85 mL，最终黄酮实际得率为7.83%，预测值与实测值差异不大，且工艺稳定性在重复性试验下证明有一定可靠性，表明此响应面优化法对蛇床子总黄酮的提取有参考价值。

2.4 杀虫活性测定结果

蛇床子提取物对2种试虫的触杀活性见表4。分别采用浸虫浸叶法和玻片浸渍法测定蛇床子提取物对苹果黄蚜和朱砂叶螨的触杀活性，结果表明蛇床子提取物对2种试虫均有一定的触杀活性，且校正死亡率随提取物浓度的增大而升高。当蛇床子提取物浓度为100.0 mg∕mL时，对2种试虫的48 h校正死亡率均为100%，在最小浓度1.0 mg∕mL时，对2种试虫的的48 h校正死亡率均大于50%，但此浓度下24 h校正死亡率分别为37.86%和28.16%，触杀活性一般。在10.0、1.0 mg∕mL浓度下2种试虫的同一时间校正死亡率存在显著差异，整体来看，蛇床子提取物对苹果黄蚜的触杀活性优于朱砂叶螨。

表4 蛇床子提取物对2种试虫的触杀活性

为进一步探讨蛇床子提取物对2种试虫的毒力大小，分别测试并求出2种试虫24、48 h下的致死中浓度和毒力回归方程。由表5可知，蛇床子提取物48 h对苹果黄蚜的毒力最强，致死中浓度（LC50）为0.041 mg∕mL，大于对朱砂叶螨的毒力（LC50为0.086 mg∕mL）。由此可见，蛇床子提取物对苹果黄蚜和朱砂叶螨均表现出一定的毒力，对苹果黄蚜的毒力大于朱砂叶螨。

表5 蛇床子提取物对2种试虫的毒力测定

2.5 抑菌活性测定结果

从表6可以看出，蛇床子提取物对7种病原菌的生长均有抑制作用，且抑菌活性不同菌种间存在较大差异。其中蛇床子提取物对番茄灰霉病菌EC50为21.29 mg∕L，抑制活性最好；对苹果腐烂病菌和油菜菌核病菌的EC50分别为35.56、32.27 mg∕L，抑制作用较强；对其他4种植物病原菌的抑制活性较差，EC50均大于45.00 mg∕L。蛇床子提取物对这7种植物源病菌的抑制活性从高到低依次为番茄灰霉病菌＞油菜菌核病菌＞苹果腐烂病菌＞苹果炭疽病菌＞甘蓝黑斑病菌＞小麦赤霉病菌＞水稻纹枯病菌。

表6 蛇床子黄酮提取物对7种供试真菌的抑制毒力测定

3 小结

本研究通过浸提法结合响应面法优化单因素试验的提取工艺，对蛇床子中的黄酮含量进行了测定，确定最佳提取工艺条件：溶剂无水乙醇体积分数为64%，提取时间为23 min，体积为85 mL。最终黄酮实际得率为7.83%，且实际值与理论值差异不大。

采用浸虫浸叶法和玻片浸渍法测定蛇床子提取物对苹果黄蚜和朱砂叶螨的触杀活性，结果表明，蛇床子提取物浓度为1.0 mg∕mL时，对2种试虫的48 h校正死亡率均大于50%；浓度为10.0、1.0 mg∕mL时，对2种试虫的校正死亡率存在显著性差异。同时，蛇床子提取物对苹果黄蚜和朱砂叶螨均表现出一定的毒力，48 h的LC50分别为0.041、0.086 mg∕mL。此外，抑菌活性试验表明，蛇床子提取物对番茄灰霉病菌的抑制活性最好，对苹果腐烂病菌和油菜菌核病菌也具有较强的抑菌活性。

目前农作物病虫害的防治主要依靠化学农药，产生了严重的农药残留和抗药性问题［22］。本研究为生物源农药开发和蛇床子植物的利用提供了一定的理论依据，但同时本试验中杀虫抑菌活性均是在室内条件下进行，与田间试验结果之间可能存在一定差异［23］，关于蛇床子提取物在田间实际环境因素中的农用活性还有待于进一步研究。