不同输精方式和有效精子数量对吉林马情期受胎率的影响

刘晓辉，谭成成，张鹏举，王伟霞，朴庆林，李信涛，郎洪彦

（吉林省农业科学院动物生物技术研究所，吉林 公主岭 136100）

吉林马是通过引进前苏联重型马（阿尔登、苏重挽、弗拉基米尔等）和轻型马（顿河、苏高血、卡巴金等）与本地马杂交改良，经过28年的联合育种，于1978年成功培育出的挽乘兼用型和重挽型的新品种［1］，具有力速兼备、适应性强、耐粗饲、持久力强等特性。吉林马目前存栏量约1.5万匹，数量急剧减少，利用优良吉林马种公马精液与人工授精技术相结合是增加其繁殖数量、培育新群体的最有效方法之一。

近年来，随着人民生活方式的转变，现代马业再次兴起，赛马、休闲娱乐、肉用、乳用及生物制品的开发与利用成为马产业主要的发展方向，因此，马匹的改良与繁育变得尤为重要，亟需引进新技术与之相适应［2-6］。子宫角深部输精技术是将精液输送至排卵侧子宫角处，从子宫颈口至排卵侧子宫角约25 cm进行适度深部输精，可以降低输入的有效精子数量，提高优良种公马利用率，加快马群良种化进程［7，8］。张发宪［9］报道采用子宫角深部输精技术可以显著提高母马的受胎率，但还缺乏比较系统的研究数据。本文系统研究不同输精方式及不同有效精子数量对吉林马情期受胎率的影响，以期为提高马人工受精技术水平，加速吉林马品种改良进程提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

种公马来自吉林省松原市欣兴牧业马场。选择4匹4～12岁成年吉林马种公马，要求其体格健康无疾病、繁殖性能良好，按《种公马饲养标准》（DBN654000∕T216—2015）要求方法饲养。采精时间为每年4—7月。选择吉林马母马300匹，母马年龄为4～10岁，体格健康无繁殖疾病，发情周期正常，每天保证充足的饲草、水和光照。

1.2 主要试剂及仪器

果糖、Tris、柠檬酸购自生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素和链霉素为兽用商店购买；卵黄液为实验室自备。

离心机（型号为TDL80-2D），购自上海安亭科技仪器厂；鼓风干燥箱（型号为PH-140A），购自上海一恒科学仪器有限公司；迈朗全自动精子分析仪（型号为ML-210JZ），购自南宁松景天伦生物科技有限公司；一次性输精管（广西蒋氏动物用品有限公司）、一次性子宫角输精管（上海法国卡苏科技有限公司）。

1.3 马精液制备

1.3.1 马精液稀释液的配制准确称取Tris 3.028 g、柠檬酸1.692 g、果糖1.250 g，加入蒸馏水充分溶解、煮沸，室温冷却后，4℃保存。

1）卵黄液制备。取新鲜鸡蛋，酒精棉球擦拭蛋壳表面灭菌，去除蛋清，刺破卵黄膜，收集卵黄液体。

2）马精液稀释液组成。基础液（40+10）mL卵黄液+双抗，置于37℃水浴锅中备用。

1.3.2 精液的采集采精时，用温水清洗种公马阴茎，挑选性情温顺的发情母马做台马或使用假台马。采精人员安装好假阴道，固定好集精杯，通过注水口灌注40℃左右的温水，检查密闭性，采精时保证水温为38～40℃。待公马爬跨时，采精人员迅速站到台马右后侧，将阴茎导入假阴道内，完成采精。采精后，将集精杯缓缓向下倾斜，打开放气阀门，取下集精杯，迅速送至精液处理室，用灭菌纱布过滤精液并统计采精量。原精颜色为不透明乳白色，无异常气味，精子活力达0.6以上，密度在1.0×109个∕mL的精液才能使用。

1.3.3 精液的稀释用全自动精子分析仪对试验精液进行活力和密度检测。对试验马精子密度和精子活力计算后进行稀释，使其分别含有10×108、5×108、2×108、1×108、0.75×108、0.5×108、0.25×108、0.125×108个不同有效精子数量，分装后备用。

1.4 输精方法

由熟练掌握输精技术的人员进行人工输精，A组采用子宫体常规输精，将输精管过子宫颈口，进行子宫体输精，见图1。B组采用子宫角深部输精，子宫角深部输精是将精液输送至排卵侧子宫角处约25 cm，进行适度深部输精，见图2。

图1 子宫体常规输精部位

图2 子宫角深部输精部位

1.5 试验设计

通过直肠检查法检测母马发情状况，每天进行一次发情排卵鉴定。将发情母马随机分为2组，A组为子宫体常规输精组（n=150），B组为子宫角深部输精组（n=150）。A组继续分为A1组（n=30，输精量30 mL含10×108个有效精子数）、A2组（n=30，输精量20 mL含5×108个有效精子数）、A3组（n=30，输精量10 mL含2×108个有效精子数）、A4组（n=30，输精量5 mL含1×108个有效精子数）、A5组（n=30，输精量2 mL含0.5×108个有效精子数）；B组继续分为B1组（n=30，输精量5 mL含1×108个有效精子数）、B2组（n=30，输精量3 mL含0.75×108个有效精子数）、B3组（n=30输精量2 mL含0.5×108个有效精子数）、B4组（n=30，输精量1 mL含0.25×108个有效精子数）、B5组（n=30输精量0.5 mL含0.125×108个有效精子数）。

1.6 统计分析方法

试验数据使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，均用平均值±标准差（x±s）表示，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 子宫体一次输精有效精子数量对吉林马情期受胎率的影响

由表1可知，采用子宫体输精方式一次输精不同有效精子数量进行人工授精后，根据吉林马母马情期受胎率统计情况，试验A1、A2组比A3组情期受胎率稍有提高，但差异不显著（P＞0.05）；当有效精子数量是A3组的50%（A4组）和25%（A5组）时，母马情期受胎率分别降低了20.35和33.37个百分点，差异显著（P＜0.05）。这说明子宫体一次输精有效精子数在2.0×108～10.0×108个时并不影响母马的情期受胎率，但降低到0.5×108～1.0×108个时显著影响母马的情期受胎率。

表1 子宫体一次输精不同有效精子数量母马情期受胎率

2.2 子宫角一次输精有效精子数对吉林马情期受胎率的影响

由表2可知，采用子宫角输精方式一次输精不同有效精子数量进行人工授精后，根据吉林马母马情期受胎率统计情况，试验B1、B2组比B3组情期受胎率稍有提高，但差异不显著（P＞0.05）；当有效精子数量是B3组的50%（B4组）和25%（B5组）时，吉林马母马情期受胎率分别降低了15.62和24.97个百分点，差异显著（P＜0.05）。这说明子宫角一次输精有效精子数在0.50×108～1.00×108时并不影响母马的情期受胎率，但降低到0.125×108～0.250×108时显著影响母马的情期受胎率。

表2 子宫角一次输精不同有效精子数量母马情期受胎率

2.3 不同输精方式对吉林马情期受胎率的影响

由表3可知，吉林马母马子宫角深部输精平均情期受胎率（69.80%）显著高于子宫体常规输精受胎率（45.78%）（P＜0.05）。采用子宫角深部输精能显著提高吉林马母马情期受胎率，显著降低一次输精有效精子数量，提高种公马精液利用效率，具有重大的生产意义。

表3 不同输精方式吉林马母马情期受胎率

3 讨论

关于输精有效精子数量的研究，在驴［10］、牛［11］、羊［12］、猪［13］等已有报道，但关于马一次输精有效精子数量的研究目前国内还无报道。本研究结果表明，10×108个和5×108个有效精子数量组的吉林马母马情期受胎率略高于2×108个有效精子数量，说明增加有效精子数量，可以提高母马的受胎率，但差异并不显著。当有效精子数量减少至1×108个和0.5×108个时，母马情期平均受胎率分别下降了20.35、33.37个百分点。Oliveria等［14］研究了有效精子数量对母驴情期受胎率的影响，发现在子宫体输精的情况下，输入的有效精子数量为10×108个时受胎率为73%，当有效精子数量减少至5×108个时受胎率则下降到40%，与本试验结果有一定差距，可能是驴人工输精需要比马更多的有效精子数量才能保证受胎率。在子宫角深部输精试验中，同样验证了此结果。

Oliveria等［15］研究了冷冻精液不同输精方式对母驴情期受胎率的影响，结果子宫体输精方式情期受胎率为0%，而子宫角输精方式情期受胎率为28.26%。杨莉等［16］研究了新鲜精液不同输精方式对母驴情期受胎率的影响，结果表明子宫体输精方式情期受胎率为33.33%，而子宫角输精方式情期受胎率为45.16%。付静涛等［17］研究了常规输精和深部输精对马情期受胎率的影响，结果子宫角深部输精情期受胎率为65.72%，而子宫体常规输精情期受胎率为56.13%，说明子宫角深部输精能显著提高母马情期受胎率。本试验结果说明，与子宫体常规输精相比，子宫角深部输精能显著提高母马的情期受胎率。这一结果可能与输精的部位有关，深部输精将精液输送至子宫角前1∕3处，使精液快速到达子宫角，从而快速与卵子结合，完成受精过程，进而提高了母马的受胎率。

种公马的使用年限一般为12～15年，在使用年限内应该更好地发挥其使用效率，最大限度提高种公马的繁殖力。随着现代马业的迅速发展，马冷冻精液的使用越来越受到关注，冷冻精液的使用使种公马的繁殖能力大大提高［18］，采用冷冻精液人工授精技术，一匹种公马一年可以配种达万匹以上。如果把每一剂量冻精有效精子数量从现在的（1～2）×108个降低至0.5×108个，冻精产量就能提高50%，如果每匹种公马年平均生产冻精20 000剂，通过降低有效精子数量，一年可多生产冻精10 000剂，大大提高优良种公马的使用效率。

4 结论

子宫体常规输精一次有效精子数达2×108个以上或子宫角深部输精一次有效精子数达0.5×108个以上，吉林马母马情期受胎率可达60.00%以上；采用子宫角深部输精方式能显著提高吉林马母马的情期受胎率，对吉林马乃至整个马业生产具有重大意义。