干细胞在宫腔粘连治疗中的应用

张舒荣，杨春润，邵旭萍，邹永辉，李长忠

宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）是指子宫内膜基底层由于机械性或感染性损伤，引起宫腔部分或完全闭塞。由于大多数患者没有明显的症状，所以，目前无法统计出IUA 的真实患病率[1]。但是从临床角度来看，IUA 患者常伴有月经改变、继发性不孕以及复发性流产等，因此对于IUA 的治疗非常必要。宫腔镜下粘连松解术是IUA 的标准治疗方法，术后采取辅助治疗，预防粘连复发及促进子宫内膜再生，尽管如此，中重度IUA 患者术后粘连复发率仍较高，可高达62.5%，且自然妊娠与辅助生殖技术助孕后总的妊娠率仅为22.5%～33.3%，远不能达到令人满意的结果[2]。既往关于IUA 治疗的研究重点为放置子宫支架、Foley 导管、透明质酸和激素替代疗法，然而近年来，生物疗法的重要性日益凸显，特别是干细胞疗法在再生医学中取得了显著的疗效，这为妇科疾病的治疗提供了新的思路。理论上来讲，干细胞及其衍生物可用于恢复体内因疾病或创伤而损坏的任何组织。因此，干细胞治疗为受损、子宫内膜的修复带来了新希望。现就干细胞治疗IUA 的理论基础、各种不同来源干细胞治疗IUA 的进展进行综述。

1 IUA 的发病机制

子宫内膜是一种可高度再生的组织，周期性的脱落、修复和再生。子宫内膜的脱落与再生是同时发生的，在这个过程中，子宫内膜中超氧化物歧化酶表达增加，氧自由基增加，上调炎症因子和趋化因子的表达，招募炎症细胞进入子宫内膜，这些炎症细胞分泌蛋白水解酶，在破坏子宫内膜的同时，启动子宫内膜的修复[3]。当子宫内膜受损而未能充分自我修复时，子宫内膜会发生纤维化形成IUA。子宫内膜纤维化是IUA 的主要病理特征，表现为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积和生长，取代正常的子宫内膜，同时产生多种促进基质合成与降解的细胞因子[4]。这些细胞因子在IUA 的发生中有重要作用，有观点认为转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表达可激活核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路，反之NF-κB 信号通路又可诱导TGF-β 和CTGF的表达，形成正反馈来促进纤维化过程进而导致IUA[4]。此外，子宫内膜基底层中存在内源性和外源性干细胞，其可被功能失调或萎缩的子宫内膜激活，修复子宫内膜，但是当创伤损伤子宫内膜基底层时，内源性干细胞数目减少，周围血管闭塞，使得外源性干细胞和组织修复相关分子无法通过血液循环到达受损的子宫内膜处，内、外源性干细胞数目减少导致子宫内膜修复障碍[5]，引起子宫内膜纤维化，纤维化标志物（TGF-β 和CTGF）会改变残存子宫内膜干细胞的微环境，导致残存的子宫内膜干细胞被错误的诱导分化为成纤维细胞，从而导致IUA[6]。目前已证实外源性干细胞如人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）、脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）等可下调纤维化标志物TGF-β，抑制纤维化进展，促进血管生成[5]。因此，补充外源性的干细胞——干细胞移植是IUA 非常有前景的治疗方法。

2 治疗IUA 的不同来源的干细胞

干细胞具有非常强的自我更新及多向增殖分化的能力。干细胞有4 种来源：①胚胎组织；②胎儿组织，如胎儿、胎盘（羊膜、绒毛膜）、羊水和脐带（华通胶、血液）；③成人体内特定位置的组织，如骨髓、脂肪等；④经过基因重组后分化的体细胞，即诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。胚胎干细胞源于植入前胚胎的未分化细胞，具有强大的自我更新及分化能力，但是由于其存在伦理争议、分化方向难以控制、取材困难及潜在的致瘤性，使其难以进入临床研究。因此现主要讨论另外3 种干细胞在IUA 中的应用。

2.1 胎儿组织来源的干细胞

2.1.1 UC-MSCs 长期以来，胎盘、脐带等胎儿附属物被认为是一种医疗废物，但其可能是间充质干细胞的重要来源。近年来，UC-MSCs 已被广泛用于治疗各种组织和器官损伤，如脑损伤、心肌梗死等。已有小鼠体内实验证实其能够产生神经营养因子和血管生成因子，修复血管和组织上皮，同时可通过抑制TGF-β1/Smad 信号通路的激活，抑制炎症和纤维化[7]。UC-MSCs 存在于脐带血、华通胶、脐带静脉内皮下层等部位，其具有多向分化、增殖时间短、免疫原性低、易提取、移植后存活时间长和旁分泌电位高等优点，已成为细胞移植的首要选择[5]。子宫内膜的修复与大多数创伤修复过程类似，通常涉及炎症、组织修复和组织重塑3 个阶段。Zhang 等[8]研究证实UCMSCs 通过这3 个阶段治疗大鼠损伤的子宫内膜，提高大鼠的生育能力。UC-MSCs 通过归巢作用迁移到损伤的子宫内膜处，下调促炎因子，上调抗炎因子减轻炎症反应，下调TGF-β 抑制纤维化进程和提高子宫内膜干细胞活力，释放血管生成因子，促进血管生长和子宫内膜细胞的增殖、再生，以此来改善子宫内膜形态，恢复子宫内膜厚度。此外，该研究还显示UC-MSCs 多次移植在修复损伤子宫内膜、增加胚胎种植率方面显示出比单次移植更佳的效果。2022 年Zhang 等[9]用大鼠模型对UC-MSCs 修复薄层子宫内膜进行了进一步的研究，揭示了子宫内膜微环境的变化，指出UC-MSCs 不是简单地替换受损的子宫内膜，而是在多种细胞因子的诱导下归巢于受伤部位，调节炎症，恢复血供，并通过旁分泌作用刺激组织修复，并且首次确定了2 个与薄层子宫内膜损伤和UC-MSCs 移植修复相关的微小RNA（miRNA）-mRNA网络。更为重要的是，已有I 期临床试验证实人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）用于修复子宫损伤的安全性，Huang 等[10]观察了患者在移植hUC-MSCs 前后心、肺、肝、肾、卵巢等多个器官及血液、免疫等多个系统的变化，10 例患者中有9 例上述指标未出现异常，且10 例患者均未出现不适症状，同时该研究未对IUA 患者行宫腔镜手术，而是选择宫腔注射干细胞，降低了手术风险及成本，虽然该研究样本量较小，但是该研究在证明干细胞疗法安全性上有着重要的意义。因此，UC-MSCs 对子宫内膜损伤的治疗具有非常重要的临床意义和价值。关于UC-MSCs 修复子宫内膜的研究有限，但其可能是治疗子宫内膜损伤的新工具。

2.1.2 人羊膜来源的干细胞 人羊膜来源的干细胞包括人羊膜上皮干细胞和hAMSCs，均可从胎盘中提取分离。hAMSCs 可以表达典型的干细胞标志物CD90、CD105、CD59、CD49d、CD44 和人类白细胞抗原ABC（human leukocyte antigen-ABC，HLA-ABC）[11]，是间充质干细胞的潜在来源，其可在体外分化为三胚层谱系细胞，具有免疫调节的能力，且来源丰富、无伦理问题、无致瘤性、低免疫原性。早在1980 年就有临床试验使用人羊膜来源的干细胞治疗溶酶体贮积症[12]。目前研究表明，人羊膜来源的干细胞在再生医学中具有巨大的潜力，其可分化成神经细胞、造血细胞、内皮细胞等数十种细胞，在妇科疾病、肾脏疾病、自身免疫性疾病等都有广泛的应用[12]。在啮齿类动物实验中也证明hAMSCs 可修复子宫内膜。Gan等[13]设计了子宫内膜损伤的大鼠模型，发现hAMSCs移植组的子宫内膜增厚，腺体数量增加，纤维面积减少，促炎细胞因子减少，抗炎细胞因子增加。人羊膜来源的干细胞抑制TGF-β 的表达，促进基质金属蛋白酶的表达，减少胶原沉积，促进子宫内膜血管生成和增殖。该研究仅证实了羊膜来源的干细胞可修复子宫内膜，但却未对大鼠的生育能力进行评估。直到2019 年Li 等[14]首次报告了羊膜来源的干细胞有可能恢复内膜受损小鼠模型的生育能力，并且指出其可通过激活自噬途径促进子宫内膜的修复。除了自噬途径，Notch 途径也发挥了一定作用，Notch 信号通路的激活可促进hAMSCs 分化为子宫内膜上皮细胞，促进损伤子宫内膜的再生和修复[15]。目前，对于hAMSCs 的研究仅集中在啮齿类动物模型上，未来还有待于进一步研究和探索在IUA 患者中植入人羊膜来源的干细胞的可行性和有效性。

2.1.3 羊水来源的干细胞 羊水主要由水、电解质、悬浮物质（如蛋白质、激素等）和细胞组成，这些细胞绝大部分来源于胚胎，代表具有不同形态、特征和潜力的异质细胞群。目前，已经从羊水中分离出羊水间充质干细胞（amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells，AFMSCs）和羊水干细胞（amniotic fluid stem cells，AFSCs）。羊水是一种未被充分利用的干细胞来源，在再生医学中具有很大的潜力。其从废弃的胎儿附属物中提取，因此价格低廉。AFSCs 可能比多能干细胞更原始，在体外可分化成三胚层谱系细胞，可以促进免疫系统的激活释放免疫抑制因子，因而不会产生排斥反应。在啮齿类动物模型中，移植后不会产生致瘤性，同时羊水来源的干细胞可以产生神经营养因子、抗炎因子和血管生成因子，促进血管重塑，增加血管密度[16-17]，这些优点使得羊水来源的干细胞成为再生医学的理想选择。多学科对羊水源性干细胞展开了研究，如AFSCs 可刺激内源性修复机制，促进血管生成，抑制炎症反应，改善缺血损伤细胞的生存环境，从而改善糖尿病大鼠缺血性卒中后的神经功能。IUA 与炎症反应和血管损伤密切相关，根据上述研究可以推测，羊水来源的干细胞可以减轻受损子宫内膜的炎症反应，改善其微环境，促进周围血管重塑，并分化成子宫内膜干细胞。然而，到目前为止，还没有临床试验证明羊水衍生物可以修复子宫内膜，治疗IUA。

2.2 成体干细胞成体干细胞是迄今为止再生医学中唯一使用安全的干细胞。成体干细胞的主要作用是维持稳态，其通常保持在静止状态，但在细胞或组织损伤时，会被激活而增殖并分化成所需要的类型。相较于胚胎干细胞，成体干细胞无伦理问题、分化方向可控、来源广泛、易于获取，使其可以广泛应用于临床。成体干细胞通过直接分化或旁分泌作用于受损的子宫内膜促进其再生，这些旁分泌因子可参与子宫内膜增殖、血管生成及免疫调节[3]。

2.2.1 骨髓来源的干细胞 骨髓来源的干细胞包括造血干细胞、BMMSC 和祖细胞，其中BMMSC 在修复受损子宫内膜和恢复子宫内膜功能方面具有很大潜力，其易于获得、来源丰富，可分化成多种类型的细胞，且具有免疫调节性，可以分泌多种生长因子，无自身免疫排斥反应，是最为理想的移植候选细胞之一，广泛应用于组织修复。但获取BMMSC 属于创伤性操作，对患者身体健康也有较高的要求。子宫内膜损伤后，其缺血再灌注可能作为归巢诱导因素，促进BMMSC 迁移到子宫内膜组织中，在此蓄积修复子宫内膜，抑制抗炎因子的释放，增加子宫内膜的厚度，提高子宫内膜的容受性[3]。2011 年临床上首例重度IUA 患者通过使用自体骨髓来源的干细胞进行子宫内膜再生，并且通过体外受精-胚胎移植后成功妊娠。目前BMMSC 应用于临床治疗的案例仍较少，研究主要集中于临床前模型。许多啮齿类动物实验已经证明，用BMMSC 治疗医源性IUA 的小鼠或大鼠有显著改善。然而，具体的修复机制仍需进一步研究。Wang 等[18]在大鼠模型上分离BMMSC，用绿色荧光蛋白标记，通过静脉注射和宫内注射2 种给药途径进行比较，并且通过免疫组织化学分析子宫内膜的雌激素受体和孕激素受体的表达，结果发现相较于无治疗措施的IUA 大鼠模型组，BMMSC 治疗组子宫内膜增厚、纤维化面积百分比减少、雌激素及孕激素受体显著上调，提示雌、孕激素受体可能参与了子宫内膜修复的过程，且宫内给药比静脉给药的子宫内膜纤维化面积百分比更低，说明宫内给药疗效优于静脉给药。此外，BMMSC 促进组织再生中的机制还可能是其可产生多种生物活性营养因子，包括趋化因子、细胞因子和生长因子，调节局部免疫系统，促进血管生成，阻止细胞凋亡，刺激周围的实质细胞修复受损组织[5]。推测BMMSC 的再生特性可以归为以下机制：迁移到受损部位并植入，分泌生物活性营养因子，募集其他细胞并转分化参与组织再生。

2.2.2 脂肪间充质干细胞 相较于BMMSC，脂肪组织更易获得，且创伤更小。脂肪间充质干细胞和BMMSC 表型相似，都具有干细胞的特性，即都能分化为不同的细胞，但脂肪间充质干细胞的增殖速度比BMMSC 快，且来自脂肪组织的前体干细胞的数量是骨髓来源的10 倍[19]。细胞来源和丰度是决定干细胞能否被广泛应用的关键，尽管目前关于脂肪间充质干细胞在子宫内膜修复中的研究仍相对较少，但相较于BMMSC，脂肪间充质干细胞可能更有前景。已有啮齿类动物实验及临床试验证实，脂肪间充质干细胞可使子宫内膜组织纤维化减少，血管形成增加，修复子宫内膜。2020 年Lee 等[20]的临床试验指出脂肪间充质干细胞虽可改善子宫内膜的容受性，但未改善妊娠结局。Sudoma 等[21]的临床试验表明脂肪间充质干细胞可能修复子宫内膜，增加子宫内膜的厚度，并可实现妊娠，该研究选取25 例薄型子宫内膜（子宫内膜厚度＜5 mm）患者，这些患者接受其他治疗方法（雌激素疗法、宫腔镜治疗、阿司匹林疗法等）均未能改善子宫内膜的厚度，从患者腹壁抽吸获取自体脂肪间充质干细胞，将其注射到子宫内膜下，超声观测不同周期子宫内膜的厚度，结果显示，有20 例患者子宫内膜厚度增加（子宫内膜厚度＞5 mm），有效率达80%，后续在19 例患者（子宫内膜厚度＞7 mm）中进行了胚胎移植，共实现13 次妊娠，9次活产，胚胎移植有效率为57.7%，累积活产率为36%。但是目前临床上应用脂肪间充质干细胞治疗IUA 的病例数有限，有待进一步探索。

2.3 iPSCsiPSCs 是通过细胞编辑技术，将已经高度分化的体细胞去分化，将其重新逆转为原始细胞。这种将细胞编程使其恢复到多能状态的方法改变了生物医学研究。iPSCs 最早是由Kazutoshi 等创造出来的，这些细胞表现出胚胎干细胞的形态和生长特性，并且表达胚胎干细胞标志基因，充分表明多能干细胞可以直接从成纤维细胞中培养出来，具有划时代的意义[22]。iPSCs 理论上可以进行无限的自我更新，并保持分化为三胚层谱系细胞的能力，而且打破了伦理方面的限制。理论上说，iPSCs 可以促进所有医学领域的发展，iPSCs 在疾病建模、药物开发、再生医学和基因调控领域具有更加明显的优势，但是iPSCs 在疾病治疗方面进展十分缓慢，从2006 年创造出iPSCs，直到2014 年iPSCs 才首次进入临床试验，Takahashi[23]将iPSCs 衍生的细胞片移植到老年性黄斑变性患者的眼睛中，不仅达到治疗效果，且未发生免疫排斥。截至2021 年1 月11 日，全球有19 项临床试验应用iPSCs 治疗疾病，有62 项实验应用iPSCs 进行非治疗性研究[22]。2018 年，Miyazaki 等[24]成功诱导iPSCs 分化成子宫内膜谱系细胞，这表明iPSCs 可用于子宫内膜相关疾病的细胞治疗，但目前仍没有相关试验进行临床研究。

3 基于干细胞治疗的衍生疗法

3.1 干细胞联合透明质酸凝胶治疗水凝胶是一种亲水性的三维网状结构，由水溶性或亲水性聚合物交联形成。根据来源不同，水凝胶可以分为天然水凝胶和合成水凝胶。天然水凝胶广泛应用于再生医学领域，如透明质酸凝胶、海藻酸盐等。中国食品药品监督管理局已批准自交联透明质酸凝胶应用于宫腔镜粘连松解术后，其可以调节多种炎症细胞的活动，吸收时间长，吸水膨胀后可以隔离损伤的子宫内膜，同时其降解过程中产生的低分子透明质酸可以促进血管生成，以减轻术后子宫内膜的粘连，减少复发[25]。无论是透明质酸凝胶，还是干细胞疗法在独立应用于治疗IUA 方面均显示出显著疗效，那两者结合是否会产生双倍的收益，是一种治疗IUA 的新思路。Wang 等[26]将透明质酸凝胶/UC-MSCs 复合物移植到恒河猴IUA 模型的宫腔内，UC-MSCs 以透明质酸作为载体，使其能更长时间留存于宫腔，实验结果表明相比于单纯的透明质酸凝胶，UC-MSCs 联合透明质酸凝胶具有双重修复效果——物理抗黏附同时促进子宫内膜再生。Xu 等[27]以子宫内膜形态学变化和白细胞抑制因子（leukocyte inhibitory factor，LIF）作为观察指标，特别是LIF，其mRNA 的表达与子宫内膜容受性和胚胎植入密切相关，整个观察期内，联合组和凝胶组的LIF 表达均高于模型组，在后期联合组LIF 的表达高于凝胶组，证实脂肪来源的间充质干细胞联合透明质酸凝胶治疗IUA 的疗效优于透明质酸凝胶单药治疗。Wang 的研究仅设计了凝胶组和联合组2 组，Xu 的研究设计了模型组、凝胶组和联合组3 组，均未设计干细胞组作为对照。如果能设计模型组、凝胶组、干细胞组及联合组4 组，在验证联合组疗效优于凝胶组的同时，观察联合组的疗效是否优于干细胞单独治疗IUA，同时观察凝胶组与干细胞组疗效差异，结果会更加全面且更令人信服。但无论如何，干细胞和透明质酸的联合应用，为治疗中重度IUA 提供了一个新的解决方法。

3.2 间充质干细胞细胞外囊泡治疗细胞外囊泡是由细胞分泌或从细胞膜上脱落的一种脂质双层复合物，是细胞间传递信息的一种特殊媒介，具有免疫调节介质的功能，可以分为凋亡体、微囊泡和外泌体3 类。细胞外囊泡中含有DNA、RNA、蛋白质和脂质，在合成过程中，原始细胞选择性地将不同因子包装到这些囊泡中，使其获得调节代谢、血管生成和组织修复等各种不同的功能，可作为生殖疾病领域的诊断性生物标志物和治疗靶点[28]。Liao 等[29]指出间充质干细胞的细胞外囊泡可以修复子宫内膜，抑制子宫内膜纤维化，调节免疫力以及抗炎，在治疗IUA 等女性生殖系统疾病方面具有广阔的应用前景。间充质干细胞和外泌体均能修复受损的子宫内膜，促进血管生成，减少纤维化，但外泌体治疗组比间充质干细胞治疗组所需时间更短，同时，相较于干细胞来说，细胞外囊泡无法进行自我复制，因此没有致瘤风险；其还可以通过过滤进行灭菌，保存时间更长，并且不会发生同种异体间充质干细胞移植的免疫排斥的问题，还可以解决自体间充质干细胞数量少的问题[5,30]。细胞外囊泡为IUA 的治疗带来新的希望，但是其治疗IUA 仍局限于临床前阶段，确切机制尚不清楚。

4 结语

IUA 是困扰许多育龄期女性的疾病，常规预防策略和治疗的效果并不十分满意，并且不同的研究所显示的疗效各不相同，因此迫切需要探索除切除粘连和辅助治疗之外的有效治疗方法。目前，来自各种组织的干细胞已经显示出对受损的子宫内膜具有修复作用。但是目前的研究也存在一些局限，比如，大部分的研究都是使用啮齿类动物作为动物模型，人类和啮齿动物在子宫解剖和生理上有很大差异，此外，间充质干细胞本质上没有免疫特权，其移植可能会发生免疫排斥反应，治疗的安全性需要仔细评估。而且目前干细胞治疗IUA 还处于起步阶段，其治疗的变量如细胞的来源、治疗时间、细胞数、注射方法等缺乏大数据的临床试验，无法进行严谨的对比，也无法形成标准的干细胞治疗方案。尽管如此，干细胞在修复子宫内膜方面仍表现出巨大的潜力，值得深入研究。