Hela细胞裸鼠模型肝脏中IL-4的表达分析

许 瑾，覃安琪，张 兰，杜晓梦，贲祖丽，乔自林,2,3，杨 琨,2*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生物医学研究中心/生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

白细胞介素-4（IL-4）是Howard于1982年在T细胞培养上清中发现的一种多效性细胞因子[1]，活化的T淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞均可产生IL-4调节免疫应答反应。IL-4在肿瘤细胞逃逸、生长及增殖方面发挥着重要作用，有研究报道IL-4通过诱导白细胞介素4诱导蛋白1，阻碍淋巴细胞的正常生理功能，抑制机体肿瘤免疫调节，从而利于肿瘤形成[2]。韩洁等[3]发现在Hela细胞迁移和侵袭中，IL-4可通过激活巨噬细胞分泌趋化因子CCL18，激活肿瘤细胞NF-κB信号通路，促进肿瘤转移相关蛋白表达，进而促进肿瘤细胞的迁移。此外，IL-4在某些肿瘤存在时高表达，包括淋巴母细胞性白血病[4]、多发性骨髓瘤[5]、非霍奇金病[6]、急性早幼粒细胞性白血病[7]和某些实体瘤。

肝脏是机体的重要代谢器官，同时也是消化系统中最大的消化腺。肝脏通过新陈代谢将体内的某些代谢产物彻底分解或直接排出体外，对维持机体正常生命活动有着重要作用。肝的生理功能受多种细胞因子的调控，晚期肝癌患者中IL-4表达水平较高[8]，IL-4的多态性与肝癌密切相关。也有学者指出白细胞介素-4多态性会影响个体对肝脏疾病的易感性，但这一结果仍然存在争议[9]。

裸鼠具有先天性免疫功能缺陷的特点。本研究选取裸鼠为试验对象，通过构建Hela细胞裸鼠模型，取肝脏组织制备切片进行H&E染色观察裸鼠肝组织病理结构变化，免疫组化染色观察IL-4在裸鼠肝脏组织中的表达情况，进而为研究IL-4蛋白在肿瘤形成中的作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～7周龄雌性BALB/c裸鼠10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试剂与仪器

试剂：Hela细胞悬液，购自国家实验细胞资源共享服务平台；兔IL-4多克隆抗体和免疫组织化学检测试剂盒（SP-0023），均购于北京博奥森生物技术有限公司；DAB浓缩型显色试剂盒（DA1010），购自北京索莱宝科技有限公司。

主要仪器：病理组织切片机、YD-AB2生物组织摊烤片机、电热鼓风干燥箱、显微镜拍照系统等。

1.3 Hela细胞裸鼠模型构建

Hela细胞经传代培养后获得Hela细胞悬液，裸鼠肩胛部位皮下注射20 μm Hela细胞悬液，约1.0×107活细胞，获得Hela细胞裸鼠模型，饲养60 d后颈椎脱臼法处死。

1.4 组织采集与固定

构建的10只Hela细胞裸鼠模型在肩胛部位均有肿瘤形成，裸鼠处死后采集肝脏等组织立即置于4%多聚甲醛中固定，12 h后更换培养液以便长期储存。固定1～2月后取约1 cm3肝脏组织进行石蜡包埋，包埋好的组织块用病理组织切片机进行切片，粗切20 μm待组织完全暴露后改为5 μm细切。调整生物组织摊烤片机，摊片温度45 ℃，烤片温度45 ℃，制备组织切片。

1.5 H&E染色

制备好的组织切片于45 ℃烤片15 min后进行苏木精-伊红染色，切片在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及苯酒精中均放置5 min，苏木精核染约2 min，酸水分化约2～3 s，伊红染色约4 min，最后用中性树脂封片，以便后期观察。

1.6 免疫组化染色

以兔IL-4多克隆抗体为一抗，使用浓度IL-4∶PBS=1∶299，组织切片45 ℃烤片15 min后按照SP试剂盒及DAB显色试剂盒的操作流程进行脱蜡，抗原修复，阻断，封闭，滴加一抗、二抗、三抗，孵育，DAB显色，苏木精复染等操作，最后用中性树脂封片。

2 结果与分析

2.1 肝脏组织形态观察

Hela细胞裸鼠模型肝脏组织H&E染色结果见图1。裸鼠肝小叶间结缔组织较少，每个肝小叶之间没有明显的区分界线。肝细胞由中央静脉向四周呈放射状分布，肝脏组织结构较完整，静脉有明显的充血，肝血窦内也可见出血现象，肝窦内分布有枯否细胞和淋巴细胞，枯否细胞多呈长条状，静脉附近有大量嗜碱性细胞聚集。

图1 Hela细胞裸鼠模型肝脏组织切片H&E染色观察

2.2 免疫组化染色结果

Hela细胞裸鼠模型肝脏组织经IL-4蛋白免疫组化染色后阳性表达显著，结果见图2。IL-4蛋白主要在肝细胞胞质阳性表达，细胞核、肝血窦、淋巴细胞、枯否细胞均无表达。C图观察到每个肝小叶间结缔组织较少，分界不清，肝组织内有大量嗜碱性细胞聚集，且IL-4在此类细胞中无表达。

图2 Hela细胞裸鼠模型肝脏IL-4蛋白免疫组化染色结果

3 结论与讨论

IL-4是由Th2细胞分泌的多功能细胞因子，在机体免疫以及肿瘤发生过程中具有调节作用[2-3]。有研究表明在促进肿瘤形成中，IL-4主要通过3条信号通路来抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖、分化、迁移，调控肿瘤形成[10]，即通过JAK/STAT6信号通路诱导STAT6磷酸化，促进细胞产生IL-6、IL-8、VEGF等促进肿瘤形成的细胞因子间接作用肿瘤细胞；通过AKT/mTOR信号通路及MAPK信号通路增强抗凋亡蛋白的表达，促进肿瘤细胞增殖。本试验发现IL-4蛋白在肝细胞胞质中显著表达，说明在注射Hela细胞形成异源移植瘤的过程中，通过细胞过表达IL-4蛋白诱导相关信号通路，促进肿瘤细胞增殖、逃逸，有利于肿瘤形成，IL-4在肿瘤形成中发挥着重要作用。

枯否细胞（KC）本质上是一种巨噬细胞，形态不规则，常驻于肝脏内，参与肝脏固有免疫反应[11]。它具有极强的可塑性，在不同微环境下可以极化为M1和M2两种功能截然不同的类型[12]，M1型主要在促进炎症发生、引起肝脏损伤方面发挥作用；M2型的主要作用是抑制炎症反应，促进肝脏修复。但有研究发现可通过抑制KC细胞向M2型极化抑制结肠癌向肝组织转移[11]。本试验发现枯否细胞多呈长条状，在肝血窦内广泛分布，说明该细胞通过变形运动穿梭在肝血窦内，可能与肿瘤形成有关[13]，但其具体生理作用仍需进一步研究。

Hela细胞异源移植瘤的形成是多种细胞因子相互作用的结果，其中IL-4蛋白在肝细胞胞质的显著表达可能对肿瘤的形成有着重要作用，同时穿梭在血窦中的枯否细胞也有可能与肿瘤形成有关。