荧光标记多糖的制备及应用

朱敏 ，王亚楠 ，2＊

（1. 四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065；2. 四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065）

多糖是一种广泛存在于植物、微生物和动物中的可再生天然高分子聚合物，是一种可持续的环境友好材料[1]。多糖由10 个以上的单糖通过糖苷键组成，其结构通常为线性结构或支链结构，易于改性，并且具有无毒性和生物相容性高等优点，在食品、医药、造纸、纺织、印染、皮革等诸多领域中有着广泛的应用[2-3]。但是，由于多糖缺乏发光基团或荧光基团等可被特异性检测的基团，使其在复杂混合体系中的定性/定量分析较为困难。研究者采用荧光标记的方法，赋予多糖可被直观检测的荧光基团，从而实现多糖在应用过程中的可视化，以便更好地研究多糖的功能和机制，并指导其应用。

本文综述了目前荧光标记多糖的常见方法，包括多糖结构中引入荧光基团的荧光标记法和通过多糖与底物的化学反应构造共轭结构的自发荧光法。阐述了不同荧光标记方法的标记原理、标记过程和应用效果，总结了荧光多糖在不同领域的应用，以期为多糖的相关研究提供参考。

1 荧光标记法

物质的荧光特性与其共轭体系的大小、共平面性、刚性程度、取代基的种类/位置等因素相关，可通过为多糖设计共轭结构来赋予其荧光特性[4,5]。相比于在多糖结构中设计合成合适的共轭结构，将商用荧光素引入多糖并形成共轭体系是相对便捷的方法。商业荧光素大都具有光谱特性优良、化学稳定性高的荧光基团和便于接枝的反应基团等固定结构[6]，本节对其性质及在多糖荧光标记中的应用进行了总结。

荧光标记法通过接枝荧光素赋予多糖荧光基团，在多糖的相关研究中应用广泛。多糖/氧化多糖通常具有大量的-OH 基团、-COOH 基团和-CHO基团[7]，荧光素在多糖上的接枝反应大多在这些基团上发生。

1.1 在多糖-OH 基团荧光标记

1.1.1 5-(4,6-二氯三嗪)氨基荧光素（DTAF）荧光标记

荧光素DTAF 的反应基团为二氯三嗪基，该基团反应活性很高，可在常温、碱性条件（pH＞9）下与多糖羟基发生亲核取代反应[8]，如图1 所示。该标记方法在水环境中一步发生，可基本保留耐碱多糖（如纤维素）的天然特性[9]。在0.1 mol/L NaOH 溶液中，用40 mg DTAF 标记100 mg 天然纤维素时，其接枝DTAF 量达到平台值，在0.2 mol/L NaOH 溶液中，达到其接枝平台值的DTAF 用量为70 mg，同时其接枝后荧光强度增加了25%，该平台值可能取决于接枝环境中的NaOH 浓度，NaOH 浓度越大，接枝的 DTAF 越多[10]。

图1 DTAF 荧光标记纤维素纳米晶的示意图[9]Fig.1 Schematic DTAF fluorescent labeling of cellulose nanocrystals[9]

Helbert W 等人[10]首先采用DTAF 对天然纤维素进行标记，研究发现DTAF 标记并未改变微纤维的物理完整性，并且能够有效地检测和表征微量纤维素酶。应用上述DTAF 标记纤维素的方法，Reid M S 等人[11]建立了检测纸张浸出时纤维素的游离、定位和损失情况的方法。琼脂、魔芋甘露聚糖、低醛基结冷胶、ι-角叉菜聚糖和κ-卡拉胶等多糖也可通过接枝DTAF 来获得可被检测的荧光[12-13]，通过这一方法可观察二元多糖复合凝胶的网络形成和多糖的相间相容性。

1.1.2 异硫氰酸酯（FITC）荧光标记

FITC 是一种在蛋白质荧光标记中广泛应用的荧光素。异硫氰基作为FITC 的反应基团，可与蛋白质的伯氨基共价结合，形成稳定的硫脲键[14]。多糖接枝荧光素，可以通过修饰多糖的羟基来实现[15]。基于FITC 化学性质稳定、光谱特性优良等优点，Dong S等人[16]开发了将FITC 分子共价接枝到纤维素纳米晶表面的三步反应途径：首先，环氧氯丙烷在碱性条件下与纤维素纳米晶羟基反应，用环氧官能团对纤维素纳米晶表面进行修饰；然后用一水合氨打开环氧环，引入伯氨基；最后伯氨基与FITC 的异硫氰基反应生成硫脲键，将FITC 共价结合到纤维素纳米晶的表面，如图2 所示。该FITC 荧光标记方法在碱性水环境中分三步进行，能够保持纤维素纳米晶的生物相容性。

图2 FITC 荧光标记纤维素纳米晶的示意图[16]Fig. 2 Schematic FITC fluorescent labeling of cellulose nanocrystals[16]

Roman M 等人[17]应用这一荧光标记方法对纤维素纳米晶进行标记，探究人脑微血管内皮细胞对FITC-纤维素纳米晶的摄取，并将其应用在纤维素纳米晶作为载体的靶向药物释放研究中。有文献报道[18-19]将该FTIC 荧光标记法对不同形貌、不同表面电荷的纤维素纳米晶进行标记，探究其生物相容性、分散性和细胞毒性等。FITC-纤维素纳米晶也被应用于探究纸张中纤维素纳米晶的位置和迁移潜力[20]。基于FITC 荧光标记纤维素纳米晶的方法，有报道[21-22]开发了FITC 荧光标记淀粉纳米晶和瓜尔胶羟基的方法，并将其应用于生物成像。

1.1.3 罗丹明B 异硫氰酸酯（RBITC）荧光标记

RBITC 与FITC 结构类似，以异硫氰基作为反应基团，可与待标物的伯氨基共价结合，形成稳定的硫脲键[23]。Mahmoud K A 等人[24]参考 Dong S 等人[16]的FITC 三步共价结合法，将RBITC 共价结合到纤维素纳米晶的表面，如图3 所示。Ding Q 等人[25]探究了RBITC 通过静电吸附法和三步共价结合法荧光标记纤维素纳米晶的结合机理，及其与RBITTC-纤维素纳米晶荧光性质之间的关系，证明了不同结合机理的荧光纤维素纳米晶具有不同的荧光性质。相较静电吸附法，三步共价结合法荧光标记后的纤维素纳米晶具有发光效率高、荧光寿命长和荧光素泄露率低等优点。

图3 RBITC 荧光标记纤维素纳米晶的示意图[24]Fig.3 Schematic RBITC fluorescent labeling of cellulose nanocrystals[24]

Ding Q[26]等人使用荧光素RBTIC 对纤维素纳米纤维进行荧光标记，开发了一种利用荧光纤维素纳米纤维分析造纸过程中留存率和损失率的新方法。Mahmoud K A 等人[27-28]将RBITTC-纳米纤维素颗粒应用于表征造纸过程中荧光纤维素纳米晶的留存率、损失率和三维定位，并与纸张的关键性能进行了关联。该法对未来纳米复合材料在提高纸张性能方面的应用具有重要价值。有文献报道[29]采用三步共价结合法同时在纤维素纳米晶上引入荧光素FITC 和RBITC，可将纤维素纳米晶转化为pH 敏感的纳米粒子，应用于pH 传感。

1.1.4 N-甲基靛红酸酐（MIA）荧光标记

由于对RNA 的 2’-OH 基团的特异性反应，MIA 常被用于RNA 的标记、纯化和分析[30]。基于MIA 反应基团苯并恶嗪环对-OH 基团的反应活性[31-32]，Deangelis P L[33]建立了 MIA 荧光标记多糖的方法（图4），该快速标记反应在温和pH 及室温条件下进行，能够保留多糖的生物活性和理化性质，用该方法得到的荧光标记产物可在-80 ℃条件下保存72 h。

图4 MIA 荧光标记多糖的示意图[33]Fig. 4 Schematic MIA fluorescent labeling of polysaccharide[33]

应用上述方法，涂宗财等人[34]将MIA 应用于阿拉伯胶和麦芽糊精的荧光标记，并制备得到荧光微胶囊；齐猛[35]用MIA 对杠柳新苷P 进行荧光标记，应用于杠柳杀虫机理的研究。

1.2 在多糖-COOH 基团荧光标记

1.2.1 5-氨基荧光素（5-AF）荧光标记

作为5-AF 的反应基团, 伯氨基可与羧基发生反应，生成稳定的酰胺结构[36]。5-AF 的标记反应通常由含碳化二亚胺基团的活化剂进行活化，碳二亚胺先与待标物的羧基反应，生成中间体O-酰基异脲，该中间体易与5-AF 的伯氨基反应，从而实现荧光素的接枝[36-38]。5-AF 的标记反应多在有机溶剂中进行，并以N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）作为活化剂[36-37]。该反应也可在水相中使用水溶性活化剂进行，如1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）[39]，如图 5 所示。Hu T Q 等人[39]开发了一种纤维改性技术，在水相中将5-AF 接枝到漂白硫酸盐浆（NBSK）纤维的羧基上，该法具有较好的重复性，可赋予纸张防伪特性。

图5 5-AF 荧光标记NBSK 纤维的示意图[39]Fig. 5 Schematic 5-AF fluorescent labeling of NBSK fiber[39]

1.2.2 氨基荧光素（AF）荧光标记

AF（5-((( 2- (carbohydrazino)methyl) thio) acetyl )-aminofluorescein）与5-AF 有着类似的荧光基团，且都以氨基为反应基团[40]。Han Z 等人[41]探究了AF 一步标记法和分步标记法的有效性，如图6 所示。在一步标记法中，用过量的1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）将多糖活化后，直接加入荧光素AF 反应；在分步标记法中，多糖羧基先与EDC 反应，生成中间体氧异酰脲，再与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）反应，形成稳定的多糖-NHS 酯，随后纯化去除过量EDC，最后接枝AF。研究发现，在一步标记法中，过量的EDC 会与AF 羧基发生反应，使AF 自聚集，导致荧光强度的急剧下降，而分步标记法能够获得更高的标记率。

图6 AF 一步标记法和分步标记法荧光标记硫酸软骨素A 的示意图[41]Fig.6 Schematic AF fluorescent labeling of chondroitin sulfate A by using one-step labeling method and multi-step labeling method[41]

Wang C 等人[40]使用荧光素AF 对糖蛋白中低聚糖进行一步标记，应用高灵敏毛细管-高效液相色谱-激光诱导荧光检测器法，建立了微量糖的分析方法，该法能赋予糖类稳定的荧光结构。焦广玲[42]使用AF 对海藻多糖进行一步标记，研究海藻多糖的抗糖尿病机理。赵小亮[43]采用AF 对多糖进行一步标记，应用于多糖与蛋白质相互作用的研究。

1.3 在多糖/氧化多糖-CHO 基团荧光标记

1.3.1 8-萘胺-1,3,6 三磺酸（APTS）荧光标记

还原胺化衍生是多糖还原末端最为常用的衍生方法之一[44]。APTS 以氨基作为反应基团，同时具有光谱特性优良的荧光基团以及3 个负电荷基团，可以为多糖提供永久电荷和可被检测的荧光，常被应用于毛细管电泳和激光诱导荧光技术中，对糖类进行分离和表征[45-48]。多糖还原末端的醛基与APTS上的胺基反应形成碳氮双键，再经过还原剂（如硼氢化钠等）还原后即可得到荧光标记多糖[45]，如图7所示。

图7 APTS 荧光标记葡萄糖的示意图[45]Fig. 7 Schematic APTS fluorescent labeling of glucose[45]

O’Shea M G 等人[45]用 APTS 标记了聚合度从 1到135 的麦芽低聚糖，并建立了用于APTS 标记低聚糖的电泳分离和表征方法，该方法有着出色的分辨率与高复现性。Evangelista R A 等人[49]探究了酸催化对APTS 荧光标记的影响，在酸性比乙酸强的酸催化剂催化下，APTS 对含有N-乙酰氨基的单糖标记效率明显提高。当柠檬酸作为催化剂时，其标记产率最高，在75 ℃条件下，可在60 min 内将几个纳摩尔的中性糖转化为APTS 衍生物。Mitra I 等人[50]使用APTS 对人血清中N- 聚糖进行荧光标记，采用微芯片电泳-激光诱导荧光法来表征人血清中N-聚糖的结构，该方法有着可靠的分离效率和可检测性，易于分离链接和定位糖基异构体，且重复性好。

1.3.2 8-氨基-1,3,6 奈三磺酸二钠盐（ANTS）荧光标记

ANTS 结构与APTS 相似，但市售价格远低于APTS。ANTS 同样以氨基作为活性基团，同时具有3个负电荷基团，可在多糖还原末端的醛基上进行还原胺化衍生，实现多糖的荧光标记[51]，如图8 所示。Jackson P[52]建立了用ANTS 对各种单糖、低聚糖和小分子多糖的还原末端进行共价标记的方法，该方法具有良好的分辨率，且成本低，操作简单快捷。Roger O 等人[53]用ANTS 对3 种磺化多糖进行标记，结果表明ANTS 能够很好地保持样品的相对分子质量、化学组成等物化性能和抗凝血活性等生物完整性，且有着较高的标记效率。Gennaro L A 等人[54-55]应用ANTS 对聚糖进行荧光标记，开发了在线质谱分析/毛细电泳结合技术，来分析聚糖混合物，并开发了离子对反相色谱与离子阱质谱检测的方法，来分离同分异构多糖。Oonuki Y 等人[56]用ANTS 对透明质酸寡糖/低聚糖进行标记，实现了透明质酸寡糖/低聚糖多分散性的可视化。

图8 ANTS 荧光标记后的葡聚糖低聚糖示意图[51]Fig. 8 Schematic diagram of ANTS-labeled dextran oligosaccharides[51]

2 自发荧光法

尽管使用荧光素赋予多糖可被检测的荧光是一种相对便捷的方法，但部分荧光素的不可生物降解性和生物毒性限制了荧光素在生物成像等领域的应用[57-58]。设计合适的化学反应，在多糖中引入生物/环境友好的共轭结构，是这类场景中更为理想的选择[59-61]。通过控制单分散π-共轭低聚物或发色团自组装，是制备具有生物可降解性、生物相容性和可设计性的自发荧光多糖的最适策略之一[62-64]。

2.1 多糖-多巴胺-聚乙烯亚胺自聚合

Zhang XY 等人[65-66]开发了多巴胺（DA）和聚乙烯亚胺（PEI）自聚为聚多巴胺（PDA）的技术，该反应在室温下无需催化剂即可进行，工艺简单，制备得到的荧光PDA 有荧光强、水分散性好、生物相容性良好和光学性能良好等优点。这一方法可被用于制备荧光多糖聚合物，应用于生物成像、药物传递和基因传递等相关研究。

Shi Y 等人[67]通过高碘酸钠氧化得到双醛淀粉，随后与DA 反应连接，再加入PEI 使淀粉-DA 结合物自聚，得到荧光淀粉聚合物（图9）。该聚合物具有稳定的光学性能、高水分散性和良好的生物相容性，可作为荧光探针和载体用于研究生物活性组分的传递。同样，多巴胺修饰透明质酸、葡聚糖和壳聚糖后，也可通过该方法制备得到相应的荧光多糖聚合物[68-70]。

图9 制备淀粉荧光纳米粒子的示意图[67]Fig. 9 Schematic diagram of preparation of starch-based fluorescent nanoparticles[67]

2.2 多糖引入席夫碱结构自发荧光

席夫碱结构是醛酮与伯胺生成的含碳氮双键的亚胺，其中碳氮共轭结构可吸收紫外-可见光，发生n-π*跃迁，从而自发荧光[71]。Wei W 等人[71-72]通过醛类交联剂与壳聚糖制备自发荧光的壳聚糖微球（图10），该荧光微球的荧光颜色随交联剂的不同而变化，而荧光强度可通过调节交联的粒径和程度来控制，同时微球的表面电荷、空腔大小和壁孔隙等也具有可控性。这些荧光微球价格低廉，具有稳定明亮的自发荧光特性和良好的生物相容性和生物降解性。该类荧光壳聚糖微球可作为药物载体，应用于药物动力学的相关研究。由于大多数醛类具有一定的毒性，可使用低毒的京尼平代替醛类作为交联剂[73-75]。

图10 壳聚糖与戊二醛的反应示意图Fig. 10 Schematic diagram of reaction between chitosan and glutaraldehyde

含有醛基的多糖/氧化多糖在胶原/明胶中传质时，可在一定条件下与胶原/明胶的氨基反应生成席夫碱结构，从而实现多糖/氧化多糖传质的可视化[76]。Song Y 等人[77]通过观测氧化海藻酸钠和二醛羧甲基纤维素钠等氧化多糖与胶原结合生成的自发荧光的席夫碱结构，探究不同氧化多糖在皮革中的传质行为。

3 荧光多糖的应用

荧光多糖由于其接枝荧光素的优良光谱特性，可实现多糖在应用过程中的可视化，常用于研究多糖的功能与作用机理。

荧光标记技术是多糖类药物体内药代动力学研究的关键技术。由于多糖在生物体内难以进行检测，且易受内源性多糖的干扰[78]，因此荧光标记技术在该研究中得到广泛应用。Sun M M 等人[79]使用FITC 对马尾松花粉多糖进行标记，对多糖在细胞中的传递进行示踪，证实马尾松多糖通过内吞作用进入巨噬细胞。Wang K 等人[80]通过对当归多糖进行琥珀酰胺化学修饰，使其与近红外荧光染料Cy5.5 偶联，近红外荧光成像显示当归多糖口服后，可被吸收并循环到血液中，从而分布到各个器官。Roman M等人[17]研究了人脑微血管内皮细胞对FITC-纤维素纳米晶的摄取，证实了纤维素纳米晶作为载体的靶向药物释放应用中的潜力。荧光标记技术对多糖在生物体内的定位，作用机理和代谢机制等的研究具有重要意义。

基于多糖的高分子骨架，可开发具有优良光谱特性、良好加工性能和生物/环境友好性等性能的天然多糖基荧光材料，这些材料可以应用于水质监测、食品监测和可降解智能包装材料等领域[81-82]。Chauhan P 等人[83]通过一步法制备了pH 敏感的荧光纤维素纳米晶，其颜色在pH 酸性条件下呈黄色，碱性条件下呈紫色。由于其多糖特性，该材料具有较好的可塑性，可被加工成薄膜等形态，同时基于其发色基团的pH 响应性能，该材料在智能包装领域具有一定的应用前景。同时在纤维素纳米晶上引入荧光素 FITC 和 RBITC[29，84-85]，也可将其转化为 pH敏感的纳米粒子作为传感器用于检测。刘俊等人[86]应用天然高分子电沉积技术制备了ZnO 量子点（QDs）/海藻酸钠复合膜，该复合膜具有ZnO QDs 的优良荧光稳定性和海藻酸钠的绿色环保等优点，复合膜对K3[Fe(CN)6]和Cu2+具良好的荧光检测作用，在电化学检测领域中具有应用潜力。Chen W 等人[87]制备了Mn 掺杂ZnS 量子点/海藻酸钠纳米复合微球，该微球具有ZnS 量子点的荧光特性和海藻酸钠的生物环境友好性，可用于金属离子检测。

荧光标记是糖芯片处理检测芯片反应信号的主要方法。糖芯片技术是将多糖固定于化学修饰后的基质上，利用多糖探针与蛋白质等待测样品的特异性作用，对多糖探针的信息变化（即糖芯片的反应信号）进行检测，从而实现对待测样品进行分析测试的方法[88-89]。对多糖探针进行荧光标记后，糖芯片的反应信号可通过多糖探针特异性反应前后的荧光强度变化来检测[90]。焦广玲[42]使用海藻多糖芯片筛选与糖尿病蛋白具有特异性作用、有抗糖尿病作用的海藻多糖，应用于新型糖尿病药物研发。赵小亮[43]构建了海洋多糖芯片，运用该芯片研究了流感病毒蛋白、胰淀素和结缔组织生长因子等疾病相关蛋白与海洋多糖的相互作用和结合特点，应用于海洋多糖药物的开发。Baum A 等人[91]使用糖芯片技术对不同工艺提取的果胶的结构特征和质量进行分析，从而指导相关工业生产过程。

荧光标记技术有望助力皮革行业多糖基无铬鞣剂的研发与应用。氧化多糖鞣剂可替代铬鞣剂进行鞣制，促进皮革工业的绿色可持续发展[92]。Ding W 等人[93-95]用高碘酸钠氧化法制备了氧化海藻酸钠鞣剂，该绿色无铬鞣剂的鞣制性能和生态性能优良。改性壳聚糖类鞣剂可赋予皮革优良的湿热稳定性、物理机械性能和感官性能，具有一定的开发潜力[96-97]。双氧水-高碘酸钠氧化法制备得到的二醛羧甲基纤维素鞣剂具有类似铬鞣剂的鞣制性能，具有良好的应用前景[98]。但该类鞣剂在皮革纤维网络中的传质规律及交联鞣制机理，目前仍缺乏深入研究。荧光标记技术可实现多糖类鞣剂在皮革纤维中传质行为的可视化[77]，为该类鞣剂的分子开发与设计提供理论参考。

4 总结与展望

多糖具有大量的活性基团可供荧光标记，从而能便捷地赋予多糖可被检测到的荧光。此外，还可采用自发荧光法，实现多糖的生物成像。因此，荧光标记是实现多糖分布和作用可视化、探究多糖作用机理和赋予多糖新性能的有效手段。

对皮革行业而言，绿色低碳发展是未来的必然趋势，而将天然多糖基鞣剂/复鞣剂等生物质化学品应用于皮革行业正契合这一理念。荧光标记多糖技术的应用将会揭示多糖基化学品在皮革中的传质行为，指导其结构与性能的有效调控，从而有助于多糖基化学品在生态皮革制造中的应用。