水产胶原的热稳定性能和生物医学应用研究进展

张军涛，汪海波＊，徐丽明

（1. 武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430023；2. 中国食品药品检定研究院，北京 102629）

引言

天然生物大分子因固有的生物相容性和降解性能而备受关注。胶原作为其中的典型代表已被广泛应用于医疗器械和组织工程领域。作为脊椎动物细胞外基质的重要组分，胶原广泛分布于皮肤、骨骼、韧带、软骨和跟腱等部位，对组织结构和功能具有重要作用[1]。到目前为止，已知的胶原种类有29 种，根据发现的先后顺序，被分别命名为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、IV 型等[2]，天然胶原在生物体内的合成路径、分子结构和纤维重组行为等基础性科学问题已基本明确（如图1 所示）[3]。在胶原家族中，I 型胶原（以下称胶原）因较高的含量和优异的生物学性能而尤为引人瞩目，并被广泛的应用于组织工程领域[4]。

图1 胶原的生物合成途径示意图Fig.1 Schematic biosynthetic pathways of collagen

与传统的哺乳动物胶原相比，水产胶原在来源的广泛性、生物安全性和产品成本等方面均具有一定的优势，如（1）水产动物的种类及生活环境多样性造就了水产胶原多样化的结构和性能，不同种类、不同组织部位、不同养殖环境、不同生长周期甚至不同捕捞季节均会影响所得胶原的结构和性能，从而为胶原基产品的创制和应用提供更大的选择空间；（2）目前尚未有水产品造成人畜共患疾病的报道，因此，水产胶原制品比哺乳动物胶原制品具有更高的生物安全性，可以避免口蹄疫、疯牛病等病毒的传播风险[5]；（3）水产胶原不受宗教壁垒限制，具有更高的国际范围普适性；（4）水产胶原一般来源于水产品加工废弃物（鱼皮、鳞、骨等），成本相对低廉且符合环保、低碳的经济发展需求，可以促进水产加工产业链条延伸，提高技术附加值。

近年来，国内外诸多学者围绕水产胶原的制取、理化性质及其在生物医学领域的应用开展了大量研究并取得一系列成果。三螺旋结构是胶原典型的结构特征，也是其优良生物学性能和分子行为的结构基础。在受热条件下，胶原的三螺旋结构会解离成为单肽链，从而导致其耐酶降解性能、细胞调控性能以及凝胶化性能减弱或丧失。因此，热稳定性成为胶原的重要性能指标，也是影响其加工利用的重要因素。本文着重对近年来不同来源的天然活性水产胶原（不包含明胶和肽等变性产物）的热稳定性差异及水产胶原在生物医学材料领域的研究进展进行系统性回顾和综述，以期为该领域的从业者提供有益的借鉴。

1 不同种类水产胶原的热稳定性

一般采用胶原溶液的热变性温度或固态胶原的热收缩温度来表征其热稳定性，常用表征方法有乌氏粘度法、圆二色谱法和差示扫描量热法等。研究表明，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）含量越高，胶原的热变性温度也越高[6]。尽管水产胶原的氨基酸组成特征与哺乳动物类似，但水产动物种类繁多，习性和栖息环境差异较大，导致水产胶原的个体化氨基酸组成、比例，特别是羟脯氨酸和脯氨酸的含量差异较大[7]。不同水产胶原的亚氨基酸含量和热变性温度如表1 所示，水产胶原的热变性温度与物种、栖息环境等有重要关系，且与脯氨酸和羟脯氨酸含量呈一定的正相关性。暖水性鱼类的热变性温度高于冷水性鱼类，如巴丁鱼皮中的ASC 和PSC 热变性温度分别为39.3 ℃和39.6 ℃[8]，高于猪皮胶原的热变性温度（37 ℃）[9]，与牛皮胶原的热变性温度类似（40.8 ℃）[6]；而冷水性太平洋鳕鱼皮 ASC 和 PSC 的热变性温度分别为 14.5 ℃和16.0 ℃，与之相对应的是其亚氨基酸含量分别为15.7%和15.9%，远低于巴丁鱼皮ASC 和PSC 的20.6%和21.1%[10]。同一鱼种不同部位的胶原热变性温度和亚氨基酸含量也存在差异，如草鱼皮、鳞、骨中 ASC 的热变性温度分别为 35.6、34.8、36.0 ℃，亚氨基酸含量分别为14.8%、9.8%、16.0%；PSC 的热变性温度分别为 35.8 ℃、35.2 ℃、36.4 ℃，亚氨基酸含量分别为 15.5%、15.5%、14.7%[11]。

表1 不同水产胶原的亚氨基酸含量、热变性温度比较Tab.1 Comparison of imino acid content and thermal denaturation temperature of various aquatic collagen

续表1

研究表明，端肽结构会影响胶原的热变性温度。无端肽结构的PSC 中亚氨基酸含量比有端肽结构的ASC 要低，其热变性温度也相应较低。以罗非鱼皮为原料分别提取得到ASC 和PSC，其热变性温度分别为34.5 ℃和30.0 ℃，亚氨基酸含量分别为20.03%和 19.15%[12]。

2 水产胶原在生物医学材料领域的应用

近年来，大量学者致力于水产胶原在生物医学材料领域的应用研究，但是，该领域尚处于起步阶段，临床应用的案例较少，而且多以明胶和多肽的形式加以利用。本文主要针对具有完整三螺旋结构的天然水产胶原在生物医学材料领域的基础研究和应用基础研究进行综述，涉及敷料、细胞支架材料等各类形式的临床医学和组织工程材料产品（图2），产品类型包括海绵、凝胶和泡沫等。值得注意的是，水产胶原的热变性温度较低且不同来源的水产胶原热变性温度差异明显。因此，水产胶原基材料的制备过程更需要关注温度条件。一般情况下，水产胶原基材料的制备宜在低温条件下（一般低于15 ℃）进行，以免因胶原变性而影响材料性能。

图2 水产胶原在生物医学领域的应用Fig.2 Biomedical applications of aquatic collagen

2.1 创伤敷料

水产胶原具备与哺乳动物胶原类似的细胞相容性和促进伤口愈合功能，且具有更优异的吸水和保水性能[39]。水产胶原基材料的微观形貌对细胞行为具有重要的调控作用。Suzuki 等[40]以罗非鱼鳞胶原为原料，通过光刻、软刻蚀等技术制备具有表面不同微观结构的仿生口腔粘膜替代物，细胞在其表面可以形成完全分化的上皮层。此外，静电纺丝法也被用于调控胶原产品的形貌[41]。与哺乳动物胶原制品类似，化学交联、天然大分子/聚合物掺杂等方法也被用于提高水产胶原基敷料的机械性能。Raghavankutty 等[42]采用戊二醛交联胶原/壳聚糖复合膜材料的研究表明，该材料不仅具有良好的渗透性和细胞相容性，而且具有良好的止血性能。Terada等[43]制备的负载口腔粘膜角质细胞的胶原/壳聚糖复合膜可用于口腔粘膜修复。此外，有机聚合物和无机材料被广泛用于提升胶原基敷料的性能。Zhou等[44]采用罗非鱼胶原和聚乙烯醇共混制备了可诱导牙周组织再生的膜材料，通过控制聚乙烯醇和胶原的比例可以调节细胞的粘附和增殖行为。Choi 等[45]制备的鱼皮胶原和聚己酸内酯复合纳米纤维支架材料不仅可以促进细胞的粘附和增殖，而且能促进细胞的基因和蛋白质表达。Zhou 等[46]制备的鱼皮胶原/ 生物玻璃复合纳米纤维材料不仅具有抗菌活性，而且能够促进细胞的粘附、增殖和迁移以及胶原的沉积和血管内皮生长因子的分泌，进而促进皮肤创面愈合。Senthil 等[47]制备的鱼胶原/聚乙烯醇/氧化石墨烯复合纳米纤维支架材料具有良好的机械性能、细胞粘附和促细胞增殖性能以及抗菌、促伤口愈合功能。这些天然高分子、人工合成聚合物以及无机材料的添加，可以在保持水产胶原优良生物相容性的基础上赋予材料良好的机械性能和抗菌性能等特性。

2.2 仿生骨材料

水产胶原不仅可以粘附人源间充质干细胞并促进其分化[48]，而且在促进成骨细胞分化性能方面优于哺乳动物胶原[46]。Hassanbhai 等[49]的研究表明，水产胶原的性能可以达到商品化哺乳动物源胶原基骨修复材料的要求，且具有更好的热稳定性和促细胞增殖效果。Diogo 等[50]通过冷沉淀凝胶化和EDC 交联方法制备的鱼胶原/ 玻尿酸复合支架无需外源诱导性成分即可促使人源脂肪干细胞分化为软骨。

为了获得性能良好的仿生骨材料，可采用在胶原支架材料中进行生物矿化或者直接将胶原与无机材料共混的方法实现。采用3D 打印[51]、静电纺丝[52]等技术以单一胶原或掺杂海藻酸钠、硫酸软骨素、聚合物等材料制备支架材料，进而通过生物矿化可获得具有良好机械性能的仿生骨材料。Camara 等[53]以罗非鱼皮胶原与纳米磷酸钙共混制备了与天然骨成分类似的骨替代材料（水/ 胶原/ 磷酸钙=6.5/53.9/39.6）。与哺乳动物胶原相比，水产胶原基仿生骨材料更有优势，如Chang 等[54]采用磷酸钙矿化获得的水产胶原/羟基磷灰石悬浊液经真空抽滤制备了复合材料，其抗压强度高于猪胶原制备的复合材料。此外，单壁碳纳米管[55]、生物活性玻璃[56]等也被用于提高水产胶原基仿生骨材料的机械性能。

2.3 药物负载和缓释

胶原海绵和水凝胶材料具有优良的贯穿孔隙结构和生物降解性能，通过负载不同的药物或天然活性组分，不仅可以实现负载物的缓释，而且能够赋予胶原海绵额外的性能。在胶原基材料中负载抗生素、银纳米粒子以及植物抗菌组分可以使其具有更优异的促伤口愈合性能、抗菌性能[57]。胶原/壳聚糖复合材料也被用于制备负载药物的纳米微球，如Tran 等[58]制备的负载洛伐他丁的胶原/壳聚糖复合纳米微球具有可控缓释性能，从而提高药物的生物利用度。Nguyen 等[59]制备了具有pH 响应性的水产胶原/卡拉胶复合凝胶微球，可用于别嘌呤醇的负载和可控缓释。胶原/无机物和胶原/聚合物复合材料同样可以用于药物负载和缓释，如Li 等[60]制备牛蛙皮胶原/碳纳米管复合凝胶并用于硫酸庆大霉素缓释，碳纳米管的加入可以提高复合凝胶的稳定性和药物的缓释效果。Liang 等[61]通过在鱼鳞胶原/聚乙烯醇复合膜材料中负载山梨酸钾提高材料的抗菌性能。

2.4 其他类型胶原基材料

Krishnan 等[62]以尖吻鲈鱼鳞胶原制备的人工角膜材料具有比人源羊膜更好的溶胀比、耐酶降解性能和抗菌性能，且其透光性和机械性能均达到临床需求。将罗非鱼鳞通过脱细胞和脱钙质得到的人工角膜材料，不仅具有良好的缝合性能、生物相容性、透光性能和光散射性，而且具有一定的球面曲率，适用于眼科手术移植[63]。Li 等[64]将鲈鱼胶原与壳聚糖共混并经1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺交联后得到的海绵材料可以防止脑组织粘附并抑制炎症，从而促进组织再生和创面愈合。

定向排列的胶原纤维结构不仅可以提供优异的抗拉伸性能，而且能够引导细胞粘附和增殖，是肌腱、跟腱修复和替代的理想材料。磁场、渗透扩散、物理挤压、离心等方法已被用于水产胶原基各向异性材料的制备。Chen 等[65]采用磁场结合EDC交联的策略处理罗非鱼鳞胶原获得各向异性材料，其纤维排列方向垂直于磁场方向，且各向异性程度取决于磁场强度。Mredha 等[66]以鲟鱼鳔胶原为原料，在室温条件下通过控制中性缓冲溶剂扩散诱导胶原纤维重组的方法制备了稳定的同心轴定向纤维排列水凝胶材料，而哺乳动物胶原不能实现该材料的制备。Mredha 等[67]以鲟鱼鳔胶原为原料，通过物理挤压结合纤维重组的方式获得各向异性纤维产物，并进一步将其置于含有N,N’-二甲基丙烯酰胺的溶液中进行聚合反应获得双网络结构水凝胶，其结构、溶胀性能和机械性能均具有各向异性，引入羟基磷灰石后还可以用于骨缺损修复。Zhang 等[68]以鮰鱼皮胶原为原料，通过离心处理促使胶原纤维核结构形成定向排列，进而静置组装获得具有各向异性结构的胶原材料，该材料具有良好的拉伸性能和定向诱导细胞增殖的性能。

3 总结和展望

水产胶原与传统的哺乳动物胶原具有同源性，不仅具有类似的结构和性能，而且具有来源多样、生物风险和宗教壁垒低、成本低廉等优势。因此，围绕水产胶原的性能研究及其在生物医学材料领域中的潜在应用备受瞩目。然而，作为一种新兴的胶原资源，水产胶原的相关研究仍需进一步加强：（1）针对水产胶原种类繁多、性能差异比较明显的特点，需要进一步加强对不同来源胶原性能的差异性研究，以便为胶原基材料的制备和应用提供参考；（2）水产胶原结构和性能的多样性和差异性为开展胶原构效关联机制分析提供了良好切入点，系统、深入的开展水产胶原结构与性能之间的关联性研究可以进一步拓展胶原领域研究范畴；（3）针对水产胶原的特殊性能，需要建立一系列标准化检测和表征方法，以便客观地评价水产胶原的性能和质量。结合哺乳动物胶原的性能表征方法，需要进一步确认既有胶原表征方法对水产胶原的适用性，如针对水产胶原热变温度低的特点，在进行与热变性处理相关的检测时需要考虑降低热变性处理的温度，优化针对水产胶原的样品前处理方法；（4）充分利用或改善水产胶原性能的应用研究需进一步加强，如针对水产胶原的热变性温度和体内降解性能与哺乳动物胶原的差异，研发具有降解过程可控的生物医用材料；（5）利用现代技术手段改善胶原的热稳定性、耐酶降解性和生物力学性能，以满足应用需要。