Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤干细胞中的作用研究进展

田宇佳，魏铭，赵辉

1大连医科大学附属第二医院研究生院，辽宁大连 116027；2大连市第三人民医院呼吸与危重症医学科，辽宁大连116091；3大连医科大学附属第二医院健康管理中心，辽宁大连 116027

《2020年全球癌症报告》指出，2020年全球新发恶性肿瘤约1929万例，其中乳腺癌、肺癌居前两位，且呈逐年增长趋势；全球恶性肿瘤死亡近996万例，成为全球第二大死亡原因，其中肺癌、乳腺癌、大肠癌等恶性肿瘤的死亡率呈升高趋势[1]。目前，恶性肿瘤的检查和诊断手段已取得很大进步，提高了肿瘤的诊断率，新的治疗手段的出现也为肿瘤治疗提供了更多的方案。然而，恶性肿瘤生长迅速，确诊时往往已出现远处转移，且针对已经发生靶器官转移的晚期肿瘤患者治疗手段有限，疗效不理想[2]。因此，研究肿瘤发生发展的机制对于肿瘤的诊断、治疗具有重要的临床意义。对肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)深入研究发现，CSCs与肿瘤的形成、侵袭和复发密切相关[3]，而Wnt/β-catenin信号通路在CSCs中发挥着关键作用[4]。因此，了解和掌握Wnt/β-catenin信号通路在不同CSCs中的作用，有可能为恶性肿瘤的治疗和预防提供新的靶点和研究方向。

1 CSCs概述

在肿瘤组织中，少数肿瘤细胞由于多基因突变而停止在某个分化阶段无限增殖，具有干细胞的特性，被称为CSCs。肿瘤干细胞学说认为CSCs具有以下几个主要特点：一是自我更新、无限增殖和多向分化的能力，可启动肿瘤发生，是肿瘤生长的根源[5]；二是较强的促血管生成能力和致瘤性，可维持肿瘤营养供给并促进其生长[6-7]；三是对放疗和化疗药物有较强的抵抗力，这可能是肿瘤耐药、侵袭、复发的根本原因[8]。目前，在造血系统肿瘤[9]、乳腺癌[10]、肠癌[11]、脑胶质瘤[12]等恶性肿瘤组织中均证实了CSCs的存在。CSCs不仅与肿瘤的形成和进展有关，也与肿瘤的复发和耐药密切相关。在肿瘤治疗过程中，应用传统方法完全杀灭CSCs十分困难，尤其是已经转移到血液或靶器官的CSCs，而这部分CSCs也是引起肿瘤复发的关键因素[13]。因此，只有杀灭CSCs才是真正意义上的根治肿瘤。

CSCs的表面一般存在有助于区分其与其他肿瘤细胞的标志物，如ALDH1、CD133、CD44和SOX2等，这些标志物在不同组织和肿瘤中的表达水平并不完全相同[14]。此外，CSCs可通过多种信号通路如Wnt/β-catenin、Notch、JAK/STAT、Hippo-YAP/TAZ等发挥干细胞样特性，其中Wnt/β-catenin信号通路发挥着重要作用[4]。

在Wnt信号通路中，Wnt配体与膜蛋白受体结合后可引起一系列信号因子的改变。Wnt/β-catenin信号通路作为经典的Wnt信号通路发挥着重要作用，当没有Wnt配体激活该通路时，β-catenin聚集在细胞质内，无法向核内易位，迅速被糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)磷酸化并隔离在破坏复合体(由APC-Axin-GSK3β-CK1组成)中，导致相关的蛋白酶体降解；当有Wnt配体存在时，Wnt配体结合细胞膜上的卷曲同源物和肺耐药蛋白5/6(lung resistance related protein 5/6，LRP5/6)受体共表达，引起散乱蛋白聚集，使该通路呈激活状态，细胞质内的β-catenin不能被GSK3β磷酸化，故大量积累并向细胞核内易位，与T细胞特异性因子(TCF)/淋巴样增强因子(LEF)或共活化因子(如Pygo和Bcl-9)互动，调节Wnt信号通路下游靶基因(如c-myc、Axin2和DKK1等)的表达，最终发挥相应的功能[15]。最新研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在调控CSCs的自我更新、增殖及肿瘤形成、侵袭、转移和耐药方面起着至关重要的作用[16]。

2 Wnt/β-catenin信号通路在CSCs中的作用

2.1 在肠癌干细胞(colorectal cancer stem cells，CCSC)中的作用 肠道肿瘤发生发展的主要原因是Wnt/β-catenin信号通路的过度激活[17]。APC-Axin-GSK3β-β-catenin复合体中任一基因突变或缺失都可激活此通路，导致CCSC过度更新、增殖和转移，有利于肿瘤形成[11]。富亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)是一种新鉴定的CCSC表面标志物，也是Wnt/β-catenin信号通路的关键分子。LGR5在肠癌细胞中表达增加，当其缺失时，β-catenin的核内易位减少，同时c-myc和Cyclin D转录水平下降，诱导CCSC凋亡并使其生长受到抑制[18]。此外，多种重要因子也可通过Wnt/β-catenin信号通路调控CCSC的干性特征，如RNA结合蛋白3(RNA binding motif containing protein 3，RBM3)在HCT 116和DLD-1肠癌细胞系中过表达，导致侧群细胞占比增加，细胞球体数量增多，干细胞标志物(DCLK1、LGR5和CD44)表达增加，提示RBM3可促进CCSC的自我更新。RBM3过表达可增高核内β-catenin水平和TCF/LEF的转录活性，还可使GSK3β失活，导致β-catenin磷酸化水平降低，从而维持CCSC的增殖能力[19]。Zeste同系物2(Zeste homologue 2，EZH2)可通过激活Wnt/β-catenin信号通路使细胞周期停滞在G1/S期，从而维持CCSC的增殖能力[20]。环境改变也可通过Wnt/β-catenin信号通路影响CCSC的干性特征，如缺氧使CCSC表型(c-myc、SOX2和Oct4)和编码DNA结合蛋白的抑制因子2(inhibitor of DNA-binding 2，Id2)表达增加，在信号转导后β-catenin的稳定性增加，Wnt/β-catenin信号分子(Wnt1、TCF4和Cyclin D)表达增加，提示缺氧可通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强体内和体外CCSC的增殖克隆能力。相反，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可抑制缺氧诱导的CD44+CCSC球体的形成，降低Id2的表达水平[21]，而Id2水平升高可减缓小鼠移植瘤的生长速度。由此可见，Wnt/β-catenin信号通路和Id2共同介导了缺氧所致的CCSC增殖和转移[21]。

MicroRNAs(miRNAs)可能是CCSC特性的调节器，不仅调控其自我更新和增殖能力，还可维持其侵袭和转移能力[22-23]。在肠癌中已经发现多种miRNAs通过Wnt/β-catenin信号通路调控CCSC的功能。miR-21、miR-93、miR-203、miR-215、miR-497可调控CCSC的生长和生存信号，从而调节恶性肿瘤的治疗敏感性[24]。在HCT 116和SW480细胞系中加入miR-3120-5p，细胞中Oct4、SOX2和Nanog的表达增加，肿瘤细胞的球体形成能力增强，表明miR-3120-5p促进了细胞的自我更新和克隆形成。同时，负调控因子Axin2的表达水平下降，核内β-catenin增多，表明miR-3120-5p可通过Wnt/β-catenin信号通路促进细胞的自我更新和增殖[25]。选择性抑制Axin2的靶点，可导致Wnt信号通路下游信号转录反应及时终止。高表达miR-103/107可通过靶向抑制Axin2、上调β-catenin而延长Wnt/β-catenin信号的持续时间。Wnt/β-catenin信号通路激活可增加CCSC标志物(CD44+)的表达和侧群细胞的数量，也可增加肿瘤球体的数量和体积，使其致瘤能力增强100倍[26]。miR-103/107-Axin2轴参与了化疗耐药和肿瘤复发。在裸鼠皮下植入携带荧光素酶的HCT 116衍生物，待原发肿瘤长至50 mm3时手术切除肿瘤，8周后应用活体成像系统监测原发部位或远处肿瘤的复发情况，结果显示对照组小鼠肿瘤未复发，但注射miR-103/107过表达细胞的小鼠出现肿瘤复发，提示miR-103/107-Axin2轴可能为治疗侵袭性大肠癌的潜在靶点[26]。此外，miR-199a/b通过下调CCSC内GSK3β的表达和上调β-catenin而激活Wnt/β-catenin-ABCG2途径，促进CCSC的耐药与侵袭[27]。菱形结构域蛋白1(rhomboid domain containing 1，RHBDD1)在肠癌中高表达，可促进淋巴结转移及远处转移，其机制为过表达的RHBDD1通过降低β-catenin在细胞质内的磷酸化水平，上调Wnt信号通路靶基因ZEB1的表达，从而促进结直肠癌转移[28]。RHBDD1可维持干细胞样表型并促进结直肠癌发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[28]。KDM3家族组蛋白去甲基化酶(KDM3 family histone demethylases)是一种表观遗传因子，对CCSC的致瘤潜能、存活能力和转移潜能具有重要作用。KDM3可募集组蛋白甲基转移酶MLL1促进H3K4甲基化，从而上调Wnt靶基因(Axin2、DKK1和c-myc)的表达[29]。因此，上下游靶点失控导致了Wnt/β-catenin信号通路的激活，引起CCSC在远处定植后发生无限增殖、自我更新，最终形成肿瘤。靶向阻断该通路的信号转导抑制CCSC的干性特征，可抑制肠癌的发生、发展、转移和治疗耐药性。

2.2 在肺癌干细胞(lung cancer stem cells，LCSC)中的作用 Wnt/β-catenin信号通路参与调控LCSC的增殖、克隆形成、转移和耐药[30]，这与β-catenin的核内积聚密切相关。β-catenin可通过上调LCSC标志物Oct4的表达，增强细胞的增殖、克隆、迁移和耐药能力。应用伊曲康唑诱导A549细胞株后，β-catenin和CD133表达下调，肺癌细胞的干细胞特性相应下降[31]。Wnt/β-catenin信号通路下游分子CD44在肺癌中过度表达，过表达的CD44可促进β-catenin向核内易位，激活Wnt/β-catenin-FOXM1-Twist信号转导通路，引起CD133+、CD44+肺腺癌干细胞发生侵袭和转移[32]。Roy等[33]发现，使用1,2,3,4-四氢异喹啉(THIQ)抑制CD44可调控Wnt/β-catenin信号蛋白的表达，而沉默β-catenin可降低CD44的表达，表明CD44与β-catenin之间存在蛋白-蛋白相互作用。抑制CD44可使顺铂耐药的CSCs对顺铂趋化，从而改善肿瘤患者的预后。Wnt/β-catenin通路激活后，下游因子FOXM1诱导CD133+、CD44+LCSC发生EMT，导致癌细胞侵袭和扩散能力明显增强[32]。CD44作为LCSC的标志物，可激活Wnt/β-catenin信号通路，上调Nanog和Oct3/4的表达，增强肺癌细胞的自我更新能力和耐辐射性[32]。Liu等[34]发现，沉默β-catenin可抑制Oct4、Nanog介导的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)耐药性和EMT过程。Wnt/β-catenin信号通路是治疗具有CSCs样特性和EMT表型的NSCLC进展和转移的潜在靶点。Wnt/β-catenin信号通路过度激活可启动肿瘤血管生成，这与肺癌的发生和发展关系密切。MORC家族CW型锌指蛋白2(MORC2)是一种高度保守的蛋白，与多种恶性肿瘤的形成、生长有关。研究发现，MORC2在肺癌A549细胞株中过度表达，致使β-catenin核内易位增多，同时血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-7、MMP-9、MMP-2表达水平升高，促进肿瘤血管生成，导致肿瘤扩散和生长[35]。MORC也可增加LCSC标志物ALDH1的表达，维持LCSC的干性特征。丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1(serine-arginine protein kinase 1，SRPK1)在NSCLC中过度表达，使肺癌A549和Calu3细胞系中β-catenin核内易位和TCF/LEF转录活性增强，导致靶基因CD44、CCND1、c-myc和c-jun表达增加，促进血管生成，从而导致肿瘤的发生[36]。相反，抑制SRPK1可降低β-catenin核内易位和靶基因的转录活性，从而抑制LCSC的增殖、克隆形成、成瘤潜能、转移和耐药性[37]。因此，上述因子可通过正向调控Wnt/β-catenin信号通路而维持LCSC的功能和特性，对肺癌的治疗和预后判断具有重要参考价值。

此外，一些负向调控因子如Axin2、DKK3、GSK3β和上皮钙黏素(E-cadherin)等通过Wnt/β-catenin信号通路维持LCSC的功能和特性。研究发现，miR-582-3p可下调Axin2、DKK3和SFRP1的表达，促进肺癌的复发、转移和耐药[38]。相反，拮抗miR-582-3p可有效抑制异种移植瘤小鼠肺癌的发生和发展[38]。miR-19a/b可靶向抑制GSK3β的表达，激活Wnt信号通路，促进LCSC的自我更新、增殖、克隆和耐药[39]。此外，E-cadherin可抑制β-catenin从细胞膜向细胞质内转运，从而影响干细胞的功能[40]。下调肺癌A549细胞株中E-cadherin的表达，可上调巢蛋白(Nestin)、c-myc、Oct3/4和β-catenin的表达，促进CSCs的增殖、血管形成、生长和侵袭[41]。上调E-cadherin的编码基因CDH1后，可抑制Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录活性，从而抑制LCSC的增殖、转移和复发[42]。上述因子表达下调可促进Wnt/β-catenin信号通路的激活，选择性阻止其下调，可调控LCSC的干性特征，这为肺癌的治疗提供了潜在靶点。

2.3 在乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSC)中的作用 Wnt/β-catenin信号通路激活与BCSC的功能密切相关，在BCSC的增殖、克隆和侵袭中发挥着重要作用，其机制与乳腺癌中Nestin、LGR4、LGR5和低密度脂蛋白受体相关蛋白8(lowdensity lipoprotein receptor-related protein 8，LRP8)的高表达有关。Nestin是一种中间丝蛋白，与恶性肿瘤的发展和转移有关。在三阴性乳腺癌中高表达的Nestin通过上调β-catenin及下调E-cadherin、Axin、GSK3β、APC和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)，引发Wnt/β-catenin信号转导和下游靶基因c-myc、MMP-7、MMP-2和Cyclin D的转录，从而促进BCSC的存活、增殖和转移[43]。LRP8定位于乳腺癌细胞表面，具有维持BCSC特性的作用。LRP8通过增强细胞内β-catenin的活性并促使其向核内易位，使经典Wnt途径激活，增强BCSC增殖能力、异种移植模型的致瘤潜能及耐药性[10]。LGR4、LGR5是BCSC的重要标志物，可通过Wnt/β-catenin信号通路维持CSCs的干性特征，其机制为乳腺癌细胞中LGR4和LGR5过度表达，促进β-catenin向核内易位，下调E-cadherin的表达。Wnt/β-catenin信号通路激活导致下游靶基因c-myc、Cyclin D和Snail的表达增加，可促进BCSC的自我更新、成瘤潜力、迁移和EMT[44-45]。应用LGR5抑制剂MDAMB231处理BCSC后，Wnt3a可重新激活被抑制的Wnt/β-catenin信号通路，恢复BCSC的干性特征[45]。因此，对Wnt/β-catenin信号通路某些上游因子进行调控，可能是乳腺癌治疗的新方向。

EMT过程与E-cadherin、Snail、MP-1和波形蛋白的表达密切相关，作为肿瘤侵袭和转移过程中的一个重要环节，亦受Wnt/β-catenin信号通路的调控。Wnt/β-catenin信号通路的激活使乳腺癌细胞中E-cadherin表达水平下降，Snail、波形蛋白表达水平升高，从而促进EMT的发生，同时上调CSCs标志物(ALDH1、Nanog和Oct4)的表达，最终促进BCSC的增殖、克隆形成、转移、EMT和耐药[46]。相反，通过上调DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路的转导，可使MP-1、Snail和波形蛋白表达下调，抑制BCSC的生长、迁移和侵袭[47]。此外，XB130可通过PI3K/Akt信号途径促进β-catenin向核内易位，维持乳腺癌细胞的EMT进程和干细胞样特性[48]。PI3K/Akt轴可激活Wnt/β-catenin信号通路，促进BCSC的增殖、转移和EMT[49]。因此，通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性，靶向调节EMT相关蛋白的表达，可达到治疗乳腺癌并防止复发的效果。

2.4 在胶质母细胞瘤干细胞(glioblastoma stem cells，GSC)中的作用 Wnt/β-catenin信号通路可介导神经发育过程，也可维持GSC的生存和凋亡。有研究发现，Wnt/β-catenin信号通路激活可使β-catenin在GSC中的表达增加14倍以上，提示Wnt/β-catenin信号通路可调控GSC的活性[12]。Wnt/β-catenin信号通路激活可促进胶质母细胞瘤(glioblastoma，GMB)内ZEB1的表达和EMT的发生，促进GSC的迁移和侵袭[50]。受体样络氨酸激酶(receptor-like tyrosine kinase，PYK)在GSC中表达明显上调，使β-catenin核内易位增加，从而可改善细胞的运动性，稳定细胞的生长及促进神经球的形成，维持GMB的干细胞样特性和致瘤性[51]。Wnt1、Wnt3a在GSC中过表达，下调Wnt1、Wnt3a可降低CSC的增殖、迁移、化学抗性及体内成瘤能力[52]。有研究发现，Wnt3a可抑制GSK3β的活性，稳定细胞核内KDM4c(一种JmjC结构域组蛋白去甲基化酶)与β-catenin的相互作用，调节GSC的特性，促进肿瘤的进展[53]。因此，Wnt-KDM4c-β-catenin可能成为治疗GBM的新靶标。另外，GSC可自分泌Wnt诱导的信号蛋白1(Wnt-induced signaling protein 1，WISP1)，激活Wnt/β-catenin信号通路，维持肿瘤细胞的干性特征，也可通过旁分泌形式激活Wnt/β-catenin信号通路，调节肿瘤相关巨噬细胞的活性及肿瘤细胞微环境，促进肿瘤的发生与发展。肌酸可抑制Wnt/β-catenin-WISP1信号转导，抑制肿瘤的增殖和生长[54]。由此可见，Wnt/β-catenin信号通路相关因子可作为GBM预后评估的重要指标。

此外，有研究发现，β-catenin向细胞核内转移、GSK3β下调、APC突变或EMT等也可发生在甲状腺癌干细胞、卵巢癌干细胞、前列腺癌干细胞、胃癌干细胞等[55-56]中，影响细胞的自我更新、增殖、转移和耐药。因此，Wnt/β-catenin信号通路可调控多种CSCs，在不同类型的肿瘤中发挥重要作用。

3 Wnt/β-catenin信号通路抑制剂

目前针对Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂有多种类型，包括小分子抑制剂、新生血管抑制剂和重组药物(基因、病毒)等。PRI-724是一种小分子Wnt/β-catenin信号通路抑制剂，能够阻断β-catenin与下游转录因子的相互作用[57]。既往临床研究发现，PRI-724可诱导CSCs分化，增加CSCs对靶向药物的敏感性[58]；其与吉西他滨联用治疗胰腺癌具有一定的效果[59]。CWP232291是一种肽类物质，能够选择性作用于Wnt/β-catenin转录产物，有效降低survivin和cyclin D1等基因的表达，活化内质网应激通路[60]。CWP232291治疗难治性骨髓瘤和急性髓系白血病具有良好的效果[60]。Cho等[61]发现，Wnt抑制剂与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)联合应用可通过p53的介导有效抑制CSCs，抑制停药后肿瘤的再生长，该研究强调了Wnt抑制剂与5-FU联合治疗的重要性。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可通过抑制该通路的活性，对某些肿瘤的预防和治疗发挥重要作用。有研究发现，依他尼酸、非甾体抗炎药、氯硝柳胺等用于治疗其他疾病的药物，也具有抑制Wnt信号通路的作用[62]。未来这些药物可能用于治疗Wnt信号通路依赖的肿瘤。

4 总结与展望

Wnt/β-catenin信号通路在CSCs中起着关键作用，可维持CSCs的自我更新、增殖和干细胞表型，还可促进CSCs的侵袭、转移和耐药。大量研究发现，阻断乳腺癌、肺癌、肠癌、GMB、宫颈癌、前列腺癌等肿瘤Wnt/β-catenin信号通路的关键上下游靶点，可抑制CSCs的自我更新、增殖、肿瘤血管生成、侵袭和扩散，有效抑制肿瘤的发生与发展，同时可降低肿瘤的耐药性，提高治疗效果。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可有效降低该通路的活性，有望成为治疗Wnt信号通路依赖肿瘤的突破点。然而，Wnt/β-catenin信号通路对CSCs的调控机制尚未完全阐明，从起源上识别并清除CSCs、早期预防肿瘤的发生仍是肿瘤防治的重点与难点。