复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能、体成分和肠道菌群的影响

徐世微，Vivian Hlordzi，2， 邹 岷， 植心妍， 崔志英， 迟淑艳，2*

（1.广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；2.广东省水产动物精准营养与高效饲料工程技术研究中心，广东湛江 524088；3.茂名希普生物科技股份有限公司，广东茂名 525000）

鱼粉富含鱼类生长所需的蛋白质、脂质、必需氨基酸、必需脂肪酸、维生素以及无机盐等营养成分，具有高消化性和适口性（Zhou等，2005；Zhou等，2004）。然而，随着养殖业和饲料工业的蓬勃发展，鱼粉的需求量上升。面临有限的鱼粉资源，同时兼顾不与人争粮，不与粮争地的愿景，开发利用非粮型饲料资源如大宗农产品加工副产物、餐饮残渣剩余物和动物源加工副产物、水产品加工副产品或者废弃物等已成为研究热点（阮征等，2015）。

水解鱼蛋白粉（Hydrolyzed fish protein powder）是主要以冰鲜鱼或其加工副产品为原料，在一定条件下进行水解后获得的一种含游离氨基酸和不同肽链长度小肽的蛋白质产品（王新星等，2011），其中小肽分子质量主要分布在1000 Da以下，低分子量组分是保证肉食性鱼类正常生长必不可少的成分（Kousoulaki等，2009），有研究表明，饲料中用适当含量的水解鱼蛋白替代鱼粉对大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）（李本相等，2019；卫育良，2014）和大西洋鲑（Atlantic salmon）（Kousoulaki等，2012；Refstie等，2004）的生长性能不会产生负面影响。作为非粮植物蛋白源的棉籽蛋白，是将棉籽粕通过加工、生物降解或遗传改良的方式（Alam等，2018；Pelitire等，2014；Zhang等，2007）消减或钝化棉籽中的游离棉酚（申建飞等，2019），成为水产饲料优质蛋白质来源之一。不同种类的鱼对棉籽蛋白的耐受程度不同，已有研究表明添加3%~30%棉籽蛋白替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼（He等，2021；殷彬，2019）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）（严全根等，2014）、罗非鱼（Oreochromis niloticus）（林仕梅等，2011）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（Luo等，2006）和卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）（申建飞等，2019）幼鱼的生长性能不会产生负面影响。

棉籽蛋白是可替代部分鱼粉的优质植物蛋白源（严全根等；2014），但所含赖氨酸等必需氨基酸含量远低于鱼粉（Li等，2006），替代大部分鱼粉后会造成生长速度下降、饲料效率降低等（Krogdahl等，2003；Carter等，2000）问题，因此棉籽蛋白在使用量上存在瓶颈。与单一蛋白源替代鱼粉相比，复合蛋白源具有营养成分互补和氨基酸平衡等优点，已有研究表明用复合蛋白源替代一定比例的鱼粉对大菱鲆（郝甜甜等，2019）和大口黑鲈（Micropterus salmoides）（朱旺明等，2019）的生长性能和鱼粉对照组相比没有产生显著影响。石斑鱼是我国四大海水养殖鱼类之一，具有重要的经济价值，因其为肉食性鱼类，对鱼粉的依赖性较大，因此本试验以珍珠龙胆石斑鱼幼鱼（Epinephelus lanceolatu♂×E.fuscoguttatus♀）为研究对象，综合考虑氨基酸平衡和适口性等因素，以适量棉籽蛋白与水解鱼蛋白粉进行复合，探讨在降低鱼粉后石斑鱼对该复合蛋白源的使用效果，以此拓展替代蛋白源的使用方式，为石斑鱼饲料配制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计 将水解鱼蛋白粉和棉籽蛋白（氨基酸组成见表1）按一定比例进行配合后以复合蛋白源形式添加，按照约1.9%的比例递增替代鱼粉，最后一组递增量加大1倍，使复合蛋白源在饲料中占比分别为4.10%、5.90%、7.77%、9.66%、11.55%、13.44%和17.25%，分别替代鱼粉的比例为0.0%（F0）、5.0%（F5）、10.0%（F10）、15.0%（F15）、20.0%（F20）、25.0%（F25）和35.0%（F35），配制7种等氮（粗蛋白质50%）等脂（粗脂肪9%）的试验饲料（表2）。将原料粉碎后过60目筛，按照配方混合均匀后，加工成粒径为2 mm和2.5 mm两种规格的颗粒饲料（F-26（II），华南理工大学实业总公司，广东），自然状态下室温风干24 h，自封袋密封，放置于-20℃冰箱中保存备用。

表1 鱼粉、水解鱼蛋白粉与棉籽蛋白氨基酸组成%

表2 试验饲料组成及营养水平 %

1.2 饲养管理 将遗传背景一致的珍珠龙胆石斑鱼暂养在水泥池中（广东海洋大学海洋生物研究基地，东海岛，湛江），投喂商业饲料驯化饲养3周。禁饲24 h，选择健康无损伤、规格一致的珍珠龙胆石斑幼鱼[初始个体体重（31.56±0.04）g]随机分为7组，分别放养于海洋生物研究基地室内玻璃钢养殖桶内（300 L），每试验组设置3个重复，每个重复30尾鱼，养殖周期8周。每天定点投喂饲料2次（08：00和16：00），记录在此期间的饲料消耗量，投喂试验饲料至石斑鱼表观饱食。试验期间水体温度（29±1）℃，溶解氧≥5 mg/L，氨氮含量≤0.03 mg/L，每天换水占玻璃钢养殖桶水量约70%。

1.3 样品采集与处理8周的养殖试验结束，禁饲24 h后称重，记录每个重复的存活尾数，分别用于计算各处理组增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和存活率（SR）。每个重复取2尾全鱼冷冻保存用于体成分分析。用丁香酚（1：10000）将石斑鱼麻醉，每个重复取3尾石斑鱼称重、量体长用于计算肥满度，用75%酒精擦拭石斑鱼体表，无菌解剖剪剪开腹部，在无菌条件下剥离其后肠，无菌生理盐水冲洗后装入无菌冻存管并放入液氮中，用于肠道菌群分析。

1.4 饲料、鱼体概略养分分析 对饲料和鱼体样本进行常规养分分析（AOAC，1995），其中水分的测定采用105℃恒温烘干失重法测定；粗蛋白质的含量采用半微量凯氏定氮法测定；粗脂肪的含量采用索氏抽提法测定；粗灰分采用550℃灼烧恒重法测定。

1.5 肠道菌群分析 试验鱼肠道样品中微生物总DNA用MN NucleoSpin 96 Soi DNA试剂盒提取，采用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'） 和 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）扩增细菌16S rRNA基因的V3~V4区。PCR反应体系为20 μL，反应参数：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火20 s，72℃延伸6 s，30个循环；最后在72℃下再延伸7 min。用1.0 %琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行纯化和回收，纯化后的PCR产物，委托北京百迈客生物科技有限公司，通过Illumina高通量测序平台（www.biocloud.org）进行生物信息学检测分析。

将测序的原始数据进行拼接，得到高质量的Tags序列。使用USEARCH（版本10.0）将相似性高于97 %的序列聚类成同一个分类操作单元（OTUs），默认以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTUs。根据OTU数据进行标准化处理后，选取前80个物种进行相关分析。

1.6 计算方法 生长指标计算公式：

增重率/%=（末均重-初均重）/初均重×100；特定生长率/（%/d）=（ln末均重-ln初均重）/饲喂天数×100；

饲料系数=摄食饲料干重/（终末体重-初始体重）；

存活率/%=试验结束时鱼尾数/试验开始时鱼尾数×100；

摄食率/（%/d）=摄食量/[（初始体重+终末体重）/2]/天数×100；

肥满度/（g/cm3）=终末体重（g）/体长（cm）3×100。

1.7 数据分析 采用Excel 2010进行数据整理，利用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），显著水平为P<0.05。当差异显著时采用Tukey’s多重比较分析差异显著性，数据采用“平均值±标准误”表示。

2 结果

2.1 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能的影响 由表3可知，与对照组相比，各饲料处理对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的增重率、摄食率、特定生长率、饲料系数和存活率无显著影响（P>0.05），但F20和F35组的鱼体肥满度分别比对照组显著降低14.46%、15.69%（P<0.05）。

表3 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能的影响

2.2 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼鱼体成分的影响 由表4可知，各组鱼体的水分和粗脂肪含量无显著变化（P>0.05）。随着复合蛋白源替代水平的增加，各处理组的粗蛋白质含量开始出现升高的趋势，F25、F35组的粗蛋白质分别比对照组显著升高9.58%、10.14%（P<0.05）。此外各组的粗灰分含量分别比对照组显著增加30.45%、30.25%、86.93%、36.68%、33.97%、22.41%（P<0.05）。

表4 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼体成分的影响%

2.3 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肠道菌群的影响 根据生长性能的结果，对F0、F5和F35组的肠道组织进行菌群测序。结果显示，3个处理组的OTUs数分别为1823、1757和1667，无显著差异（图1）。F0、F5和F35组3个处理组共有的OTUs数为1330，特有的OTUs数量分别为107、78和102。F0与F5、F0与F35、F5与F35组 共 有 的OTUs数 量 分 别 为1580、1466和1429。此外，三组之间的Alpha多样性如ACE、Chao、Shannon和Simpson指数均无显著性差异（P>0.05，表5）。

图1 珍珠龙胆石斑鱼幼鱼饲喂3组不同试验饲料的肠道菌群OTU韦恩图

在门水平，F0组石斑鱼肠道菌群的优势门为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria），分别占肠道菌群比例为24.56%、24.79%、18.33%、8.98%（表6）。然而，三组之间的变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、酸杆菌门（Acidobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝藻门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）以及Epsilonbacteraeota的相对丰度均无显著性差异（P>0.05，表6）。

表6 珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肠道中微生物门水平前10的分布%

在属水平，石斑鱼肠道菌群中优势菌属为Muribaculaceae、乳酸菌属（Lactobacillus）、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae）、Akkermansia和拟杆菌属，分别占肠道菌群比例为8.44%、3.68%、3.17%、2.74%、2.82%（表7）。其余的菌属主要为不动杆菌属（Acinetobacter，2.05%）、大肠杆菌-志贺菌属（Es-

cherichia-Shigella，1.89%）、Cutibacterium（0.92%）、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6（1.48%）和双歧杆菌属（Bifidobacterium，0.93%）。除乳酸菌属和Cutibacterium外，其余8个菌属的相对丰度在F0、F5和F35组均无显著差异（P>0.05，表7），其中F35组的乳酸菌属相对丰度比对照组显著降低30.47%，F5和F35组的Cutibacterium相对丰度比对照组显著降低74.05%、77.30%（P<0.05）。

表7 珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肠道中微生物属水平前10的分布%

3 讨论

3.1 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能及体成分的影响 复合蛋白源为水解鱼蛋白粉和棉籽蛋白，其中水解鱼蛋白粉主要以小分子肽类和游离氨基酸为主，谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量较高（Tang等，2015；卫育良，2014；Shamloo等，2012；Chalamaiah等，2010；Liaset等，2003），可以促进幼鱼肠道上皮细胞的发育和成熟，提高蛋白质的消化和吸收，从而促进仔稚鱼的生长和发育（李文杰，2013；刘峰，2007；Cahu等，2004）。并且，水解鱼蛋白小肽分子质量主要分布在1000 Da以下，对大菱鲆（卫育良，2014）、大西洋鲑（Kousoulaki等，2012）、大西洋鳕（Aksnes等，2006）和牙鲆（Paralichthys olivaceus）（Zheng等，2012）的生长均有较好的影响。在本试验中，采用复合蛋白源替代不同水平的鱼粉对石斑鱼幼鱼存活率没有显著影响，这与尼罗罗非鱼（Mbahinzireki等，2001）的研究结果一致，表明复合蛋白源替代鱼粉后对石斑鱼幼鱼的健康没有产生不利影响。有研究表明，用动植物蛋白源替代鱼粉造成生长下降是由于适口性低引起的（Kader等，2010），但在本研究中各组的摄食率、增重率和饲料系数均无显著差异，这可能是因为复合蛋白源中的水解鱼蛋白粉含有较多的鲜味氨基酸、小肽、牛磺酸等，改善了饲料的适口性，且分子质量小于1000 Da的小肽占比达78.5%，具有耗能低、转运速度快、载体不易饱和等优点（Zheng等，2012；Mbahinzireki等，2001；SèVE，1994），使石斑鱼幼鱼保持较高的摄食率，同时水解鱼蛋白份和棉籽蛋白在蛋氨酸和赖氨酸上可较好的互补，对生长也起到了较好的作用。可见，将棉籽蛋白与适宜水平的水解鱼蛋白粉进行配伍使用可以替代35%鱼粉而不影响石斑鱼幼鱼的生长性能。

在本试验中用复合蛋白源替代不同水平的鱼粉不会对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的体成分产生负面影响。在Zheng等（2013）研究中发现，含有高植物蛋白的大菱鲆饲料中分别添加1.2%、3.7%的低分子水解鱼蛋白替代鱼粉，可提高鱼体粗蛋白质含量。在牙鲆饲料中添加不同水平水解鱼蛋白替代鱼粉也能显著提高鱼体粗蛋白质含量（许团辉等，2012）。在本试验中，当鱼粉替代比例达到20%时，鱼体粗蛋白质含量显著上升。可能是因为复合蛋白源中的水解鱼蛋白粉中含有的游离氨基酸、小肽、胺类等化学物质（王佳丽等，2003；王碧莲等，2001；Takii等，1986），更易于参与蛋白质合成，使鱼体氨基酸的吸收速度提高，促进蛋白质的吸收利用，也可能是复合蛋白源中脯氨酸的作用。荣华等（2022）研究表明，饲料中添加脯氨酸可显著提高浅色黄姑鱼的粗蛋白质含量，脯氨酸作为鱼类的功能性氨基酸能够调控胶原蛋白的合成，促进损伤组织的修复，在代谢、营养和蛋白质合成等方面 发 挥 重 要 的 作 用 （荣 华 等，2021；Karna等，2020），因此复合蛋白源中两种蛋白源均含有较高的脯氨酸，能够增强配合饲料的营养性能，在一定程度上影响蛋白质的合成。 已有研究表明，复合蛋白源替代鱼粉对牙鲆（Deng等，2006）和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）（罗嘉翔等，2017）灰分含量无显著影响，但本试验中，饲料中复合蛋白源替代鱼粉能够显著增加鱼体粗灰分含量。鱼体粗灰分含量与矿物质的沉积密切相关（李学丽等，2017），推断是复合蛋白源中的水解鱼蛋白粉含有的小肽在肠道与金属元素结合生成螯合物，增加了钙、铁等金属离子的可溶性，提高其吸收和转运速度（Zambonino等，1997），从而使鱼体粗灰分含量上升。可见，复合蛋白源可以替代35%鱼粉而不影响石斑鱼幼鱼的体成分。

3.2 复合蛋白源替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肠道菌群的影响 肠道是与食物直接相互作用的重要功能器官，其中的菌群可参与调节机体消化营养物质、免疫、肠道增殖、抗病和病原体定植等（Nayak，2010），有益菌属以改善宿主营养吸收能力和免疫调节能力等来促进宿主良好生长（Cahenzli等，2013），而有害菌属则因改变了肠道黏膜层的通透性，使细菌和其他大分子穿过黏膜屏障（Lee等，2000），良好的肠道微生态系统对鱼类健康生长尤为重要。已有研究表明，当饲料中添加水解猪血肽替代10%鱼粉后，伴随肠道中乳酸菌属的相对丰度增加，改善了珍珠龙胆石斑鱼的生长性能（He等，2021）。

在本研究中，饲料中添加复合蛋白源替代鱼粉对石斑鱼的肠道Alpha多样性没有产生显著影响，变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门为优势菌群。在浓缩棉籽蛋白、大米发酵蛋白和猪血肽等（He等，2021；He等，2021；Ye等，2020）蛋白源替代鱼粉的试验也观察到类似的结果。不管饲料组成如何，这些门水平通常构成珍珠龙胆石斑鱼的核心肠道菌群（张卫，2020；Ayiku，2020）。变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门代表了各种海洋和淡水物种中高达80%以上的肠道微生物（何娇娇等，2018；唐杨等，2017；邢孟欣，2013）。多种鱼类的肠道微生物群中细菌分类群的相似性表明，这些细菌参与了重要的宿主肠道功能，如消化、营养吸收和免疫反应等（潘厚军等，2005）。在本试验中，各组间优势菌在门水平的相对丰度没有显著差异，这表明复合蛋白源替代鱼粉不会对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肠道菌群组成产生不利影响。

在属水平上，主要为Muribaculaceae、乳酸菌属、毛螺旋菌属、Akkermansia和拟杆菌属。本试验中，饲料中添加复合蛋白源替代35%鱼粉会显著降低乳酸菌属和Cutibacterium的含量，这与大西洋鲑（Hartviksen等，2014）研究结果一致。可能与复合蛋白源中的棉籽蛋白有关，棉籽蛋白所含的甲硫氨酸即蛋氨酸，能够改善大菱鲆（Gao等，2019）和石斑鱼（Li等，2020）的肠道发育和提高肠道吸收效率，在饲料中添加适量的蛋氨酸能够改善草鱼（Su等，2018）肠道免疫功能。乳酸菌属是水生动物的有益菌，可以通过分泌乳酸等有机酸降低pH来抑制革兰氏致病菌扩散，对增强肠道免疫力、改善肠道结构、提高抗病力等具有重要意义（章文明等，2012）。Cutibacterium曾被称为痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）（UNNA，1896），与痤疮引起的毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病发生密切相关（Platsidaki等，2018）。可见，饲料中用复合蛋白源替代到35%鱼粉时，其主要优势属并没有发现显著改变，虽然潜在益生菌乳酸菌属的丰度降低，但同时也显著抑制了可能致病菌Cutibacterium。

4 结论

在本试验的条件下，饲料中复合蛋白源替代35%鱼粉不会对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的生长性能和体成分产生显著的负面影响，且没有显著改变石斑鱼肠道菌群的优势门和优势属的相对丰度，但复合蛋白源对石斑鱼肠道微生物组成和结构的影响还需要进一步分析。这一研究结果拓宽了石斑鱼蛋白源的选择和配伍，为优化其配方提供重要数据支持。