储存条件对乳酸菌饮料的活菌数有何影响

张熙乔

张永强  中学高级教师，湖南省十佳科技教师。科普中国2021年十大科普人物奖获得者，全国校园发明创意大赛、湖南省青少年科技创新大赛、湖南省创新编程与智能设计大赛、湖南省科学调查体验活动评审专家组成员。

经常饮用活菌型乳酸菌饮料可改善肠道微生物的组成，提高人体免疫力。但是，体内的乳酸菌活菌要积累到一定数量，才有机会到达并定植于小肠内，抑制有害菌生长，保持肠道微生态平衡。所以，评价活菌型乳酸菌饮料的一个重要指标是其活菌的含量。

目前，活菌型乳酸菌饮料都需冷藏保存。虽然大多数超市的乳酸菌饮料被存放在冰柜中，但有时为方便促销，部分乳酸菌饮料被摆放在常温柜台或未密封的小冰柜里。

常温下，乳酸菌饮料中的乳酸菌还能存活吗？保质期内，冷藏保存的乳酸菌饮料中的活菌数真的达标吗？外出携带的乳酸菌饮料中的活菌数有什么变化？对于肠胃敏感的人来说，提前多久将乳酸菌饮料置于常温下更合适？这些问题都值得深入探讨。

一、市场调研

走访成都市新都区的超市，挑选并记录常温、冷藏保存的乳酸菌饮料的种类及产品信息。

二、实验器材

4种活菌型乳酸菌饮料、MRS液体培养基、琼脂粉、90 mm无菌培养皿、天平、三角瓶、微量移液器、酒精灯、普通光学显微镜、RO纯水仪、超净工作台、灭菌锅、培养箱等。

三、实验方法

参照国家标准GB 4789.35—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》执行，遵循无菌操作程序。

（一）分组

将购买的活菌型乳酸菌饮料分成两组。第一组包含4种，每种12瓶，分别储存于4 ℃和常温环境中，在保质期内，每隔5天分别取1瓶检测其活菌数。第二组由2种活菌型乳酸菌饮料组成，每种7瓶，分别考察它们于常温下放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后的活菌数。

（二）制备平板培养基

称取MRS液体培养基66.2 g，将其加热溶解于1000 mL蒸馏水中，加入2%琼脂粉。将配好的培养基用121 ℃高压灭菌20 min后冷却至50 ℃左右，在超净工作台内制备平板。

（三）样品稀释、涂布及培养

1.样品稀释

将1 mL乳酸菌饮料制成1∶10的样品稀释液，混匀后取0.1 mL上述稀释液加入0.9 mLRO水中，制成1∶100的稀释液。按上述操作顺序，做成10倍递增样品稀释液。

2.涂布及培养

无菌条件下，取10^-8、10^-9或10^-10稀释梯度的稀释液0.05 mL，分别均匀涂布于2个MRS平板内，封口膜密封平板后于37 ℃环境中倒置培养48 h。

（四）平板计数

选取菌落数在30～300 CFU、无散延菌落生长的平板计菌落数。每个稀释度的菌落数记录为两个平板的平均数。将上述平均值乘以相应的稀释倍数，作为每毫升乳酸菌饮料中含有的活菌数。

（五）观察菌落形态

将培养好的平板取出，肉眼观察每个平板上的菌落形态。

（六）革兰氏染色及观察细胞形态

1.革兰氏染色

用接種环挑取菌落形态不同的单菌落置于载玻片，均匀涂开后用酒精灯外焰烤干。载玻片上的菌体薄层用草酸铵结晶紫染色1 min。之后用RO水冲洗，再滴加碘液覆盖涂面染色1 min后，用RO水冲洗，用干净的吸水纸吸干多余水分，加入数滴质量分数为95%的酒精，并轻轻摇动。脱色20 s后，再用RO水冲洗，用干净的吸水纸吸去表面水分。最后用蕃红复染1 min，RO水冲洗、干燥，用显微镜观察。

2.观察细胞形态

先用普通光学显微镜的低倍镜找到待观察物象，并移到视野中央，再切换到高倍镜和油镜，观察菌体细胞形态和上述革兰氏染色结果。

四、实验观察

（一）选取实验对象

经市场调研发现，2022年暑假期间成都市新都区售卖的乳酸菌饮料主要来自伊利、蒙牛、新希望、养乐多、菊乐等5个厂家，产品类型主要有10种。挑选其中4种明确标识“活菌型乳酸菌”的产品作为本实验研究对象，如表1。

（二）不同储存温度对保质期内活菌型乳酸饮料中活菌数的影响

将4种乳酸菌饮料分别储存在4 ℃和常温的环境中，30天内其活菌数的变化如表2所示。

（三）短时间内常温环境中乳酸菌饮料中活菌数的变化

常温下，上市5 d后的“蒙牛优益C”和“养乐多”的活菌数变化如表3。

（四）乳酸菌的菌落及细胞形态

如图2，平板内的菌落均为白色、圆形，有的菌落中等偏大，有的偏小，所有菌落表面凸起、湿润，边缘整齐。所有菌体细胞经革兰氏染色处理后呈紫色，表明这些菌体均为革兰氏阳性菌（G+）。有的菌体细胞为直径0.5～2.0 μm的球形（图3b），有的为长杆或短杆形（图3c），细胞均成对或成链排列，无芽胞、不运动。

五、结果分析与结论

（一）在保质期内，冷藏与常温条件下活菌数的变化

常温储存5～10 d时，虽然乳酸菌饮料中的活菌数仍然达标，但还是建议市民购买活菌型乳酸菌饮料时，一定要从冷藏柜中挑选并尽量选择生产日期较新的产品。买回家后若不能马上饮用，一定要冷藏储存并尽快饮用。

生产企业和超市应始终对活菌型乳酸菌产品进行冷链运输，并对超市销售人员进行培训，以便引导消费者正确饮用。

（二）常温条件下储存24 h后，活菌数的变化

活菌型乳酸菌饮料常温放置超过4 h时，其中的活菌数开始显著下降。因此，建议肠胃敏感者可提前将活菌型乳酸菌饮料置于常温下，但在常温下放置的时间最好不要超过4 h。外出游玩时，未冷藏的活菌型乳酸菌饮料最好在4 h内饮用。

（三）乳酸菌的菌落及细胞形态

本实验分离的乳酸菌均为革兰氏阳性菌。目前，市面上销售的乳酸菌饮料中主要含有乳杆菌属、嗜热链球菌和双歧杆菌属三类，本实验只观察到了嗜热链球菌和乳杆菌的细胞形态，未见双歧杆菌。可能是因为双歧杆菌只能存活于绝对厌氧条件下，在兼性需氧条件下不生长。而我们的培养条件是兼性厌氧，未达到绝对厌氧，因此双歧杆菌不能生长。

综合上述实验结果，可得出结论：活菌型乳酸菌饮料中的活菌数与储存条件比如温度、时间密切相关。

六、创新性与实用性

首次探究了常温条件下，活菌型乳酸菌饮料中活菌数在24 h内的变化，为人们科学饮用活菌型乳酸菌饮料提供实验依据。同时，探索了冷藏和常温两种环境对活菌型乳酸饮料中活菌数在保质期内的变化，为企业生产活菌型乳酸菌饮料以及行业标准的制定提供参考。

实用性体现在本实验结果可引导人们正确选购与饮用活菌型乳酸菌饮料，以保证摄入足够的活菌，充分发挥乳酸菌促消化、抑制有害微生物在人体肠道内生存等作用。

感谢指导老师为本研究提供的实验条件和指导！（指导老师：解蒸）

专家点评

本文研究了活菌型乳酸菌饮料中的乳酸菌在不同条件下的数量变化，文章结构完整，思路清晰，选题恰当，联系生活实际，是一篇优秀的研究论文。

本文以生活中常见的乳酸菌饮料为研究对象，探讨饮料中的乳酸菌在冷藏和室温下活菌数量的变化，为人们正确饮用活菌型乳酸菌饮料提供实验依据，具有很强的实践性。从实验方案的设计到方案的执行，再到结果的分析，符合学生的认知能力，可由学生独立完成，有利于培养学生提出问题、做出假说、实验设计等科学探究的能力。