茶多酚对酸奶发酵品质及抗氧化活性的影响

冯子健，陈 南，高浩祥，何 强，曾维才,,

（1.四川大学食品工程系，四川成都 610065；2.四川大学食品科学与技术四川省高校重点实验室，四川成都 610065）

酸奶是牛乳经乳酸菌发酵和冷却后熟所制得的一种发酵型乳制品，因其独特的风味和良好的营养价值，深受消费者的喜爱[1]。但目前酸奶在生产和贮藏过程中仍存在着诸多问题，使产品质量不够稳定，加之消费者对酸奶的口感及功能性等要求的提高，功能性辅料的选择和营养强化型酸奶的研发已成为相关领域的研究热点[2-3]。茶多酚是茶叶中酚类化合物的总称，是茶叶中具有保健功能的活性物质，主要包括非酯型儿茶素（表儿茶素，Epicatechin，EC；表没食子儿茶素，Epigallocatechin，EGC）和酯型儿茶素（表儿茶素没食子酸酯，Epicatechin gallate，ECG；表没食子儿茶素没食子酸酯，Epigallocatechin gallate，EGCG）等成分。大量研究表明，茶多酚具有抗氧化、抑制病毒及抗辐射等多种有益人体健康的生物活性[4-5]。同时，茶多酚还具有绿色、安全及易得等优点，常作为食品添加剂应用于食品工业，对改良食品的质量与品质有积极的作用，在食品加工领域具有广阔的应用前景[6]。

目前，相关领域科研人员对酸奶的研究以发展新型发酵菌种以及添加多糖及蛋白类营养补充剂为主，针对天然植物多酚进行设计的酸奶的研究内容较少[7]。相关研究表明，酚类化合物与牛乳酪蛋白具有较强的结合能力[8]，这种相互作用会使蛋白质的结构发生变化，从而改变牛奶制品的品质。虽然已有部分研究针对酚类物质在酸奶中的应用进行探索，但缺乏对发酵过程中酚类物质主成分变化的分析，忽略了乳酸菌对酚类物质的利用和分解。

本研究通过测定和评估茶多酚酸奶的品质特性（pH、可滴定酸度、营养成分含量、持水力、质构特性、颜色及风味成分）和功能活性（茶多酚中儿茶素含量的变化及体外抗氧化活性），探究茶多酚对酸奶发酵品质及抗氧化活性的影响，为茶多酚在酸奶加工领域的开发利用提供理论与参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛乳、活润发酵乳 新希望乳业股份有限公司；茶多酚（纯度≥95%） 通泽生物科技有限公司；蔗糖 成都市沃尔玛超市；酚酞、氢氧化钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁（均为分析纯），乙腈、甲醇（均为色谱纯） 成都市科龙化工试剂厂；ABTS（2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，2,2'-联氮-二（-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验用水 为蒸馏水。

STARTER2100/3C pH计 奥豪斯仪器上海有限公司；TA.XT.Plus质构仪 英国Stable Micro Systems有限公司；CM-5色差色度仪 日本Konica Minolta公司；QP2010 SE气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 日本岛津公司；Carboxen/PDMS纤维头和固相微萃取手柄 美国Supelco公司；Agilent 1290高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）

美国Agilent公司；UV-1800BPC型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶多酚酸奶制备 茶多酚酸奶制备：称取一定质量的新鲜牛乳，添加5%（w/w，下同）的蔗糖，搅拌均匀后水浴加热至60～65 ℃，并保持30 min，随后冷却至42 ℃，备用。向48 mL预处理后的牛奶中分别添加2.5 g发酵种子（新希望活润发酵乳，该发酵种子的种类和剂量由预实验结果所确定）和2 mL不同浓度（w/v，0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和12.5%）的茶多酚溶液，使得茶多酚的最终浓度达到0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/100 mL牛乳。搅拌均匀后置于42 ℃条件下恒温发酵4 h，发酵结束后于4 ℃条件下冷藏后熟24 h，备用[9]。

空白组酸奶制备：向48 mL预处理后的牛乳中分别添加2.5 g发酵种子（新希望活润发酵乳）和2 mL蒸馏水，搅拌均匀后置于42 ℃条件下恒温发酵4 h，发酵结束后于4 ℃条件下冷藏后熟24 h，备用。

未发酵的茶多酚牛乳制备：向48 mL预处理后的牛乳中分别添加2.5 g发酵种子（低温巴氏灭菌处理，新希望活润发酵乳）和2 mL不同浓度（w/v，0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和12.5%）的茶多酚溶液，使得茶多酚的最终浓度达到0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/100 mL牛乳，搅拌均匀后，备用。

1.2.2 pH和可滴定酸度测定 称取10 g酸奶样品，使用pH计对样品的pH进行测定。

称取10 g酸奶样品，与20 mL蒸馏水混匀，滴加适量的酚酞指示剂，随后以0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，且30 s内不褪色，滴定结束[10]。样品的可滴定酸度值按下式计算：

式中：c为氢氧化钠溶液的浓度（mol/L）；V为消耗的氢氧化钠标准溶液的体积（mL）；m为样品质量（g）。

1.2.3 营养成分含量测定 水分含量测定：参照国家标准《食品安全国家国家标准 食品中水分的测定》（GB 5009.3-2016）中半固体类的直接干燥法[11]。

灰分测定：参照国家标准《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》（GB 5009.4-2016）中总灰分的测定方法[12]。

蛋白质含量测定：参照国家标准《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5-2016）中的凯氏定氮法[13]。

脂肪含量测定：参照国家标准《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6-2016）中的碱水解法[14]。

还原糖测定：参照国家标准《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》（GB 5009.7-2016）中的直接滴定法[15]。

1.2.4 持水力测定 向50 mL冷冻离心管中加入10 g酸奶样品并进行密封，随后于4 ℃条件下离心（3000 r/min）10 min，静置10 min后弃掉上清液，称量离心管与剩余沉淀物的总质量[16]。酸奶样品的持水力按下式计算：

式中：m为空离心管的质量（g）；m1为装有酸乳样品离心管的质量（g）；m2为弃去上清液后离心管与剩余沉淀物的总质量（g）。

1.2.5 质构特性测定 采用质构仪测定酸奶样品的硬度、粘性、胶粘性和内聚性。仪器的参数设定：探头选用P/36R，测试模式为TPA（texture profile analysis），触发力为5 g．测定前速度、测定时速度及测定后速度均为2 mm/s，测试距离为20 mm[17]。每组平行测定五次。

1.2.6 颜色测定 采用CM-5色差色度仪测定酸奶样品的颜色。测定的光源为D65，测量区域为30 mm，测量的类型为培养皿测量，每组样品平行测定3次，并以L*、a*、b*值来反映样品颜色的变化。其中L*代表亮度值，a*代表红绿值，b*代表黄蓝值[18]。以空白组酸奶作为标样，测量并计算其余检样的ΔL、Δa、Δb和ΔE。ΔE的计算公式如下所示：

式中：L*、a*、b*分别为样品的亮度值、红绿值和黄蓝值；L0*、a0*、b0*分别为空白组样品的亮度值、红绿值和黄蓝值[19]。

1.2.7 风味成分测定 顶空萃取条件：取酸奶样品5 g置于顶空瓶内，插入萃取头在60 ℃条件下萃取40 min。

GC条件：起始温度为45 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min的速度升温至80 ℃，保持1 min，随后以5 ℃/min的速度升温至240 ℃，保持5 min。进样口温度为250 ℃，传输线温度为230 ℃，载气为氦气，流速为2.0 mL/min，进样模式为不分流进样[20]。

MS条件：离子源温度为250 ℃，电离方式为EI，电子能量为70 eV；扫描速率为4.5 scans/s，捕获范围为30～400 m/z。

风味成分的定性和定量分析：通过检索和对比标准谱库（NIST，14.0 Gaithersburg，MD，USA）对目标化合物进行定性分析，采用归一化积分法对各物质进行定量分析[21]。

1.2.8 茶多酚中儿茶素单体含量测定 儿茶素单体标准溶液配制：参考《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313-2018），称取适量EC、EGC、ECG和EGCG标准品配制标准混合样品储备液。

茶多酚样品溶液配制：准确称取茶多酚样品10 mg并溶解于10 mL甲醇中，配成茶多酚样品储备液。

酸奶样品溶液配制：称取10 g茶多酚凝固型酸奶（浓度为0.5 g茶多酚/100 mL牛乳），加入15 mL甲醇后，以4000 r/min离心10 min（25 ℃），取上清液并经0.45 μm滤膜过滤，备用。

流动相：流动相A：将90 mL乙腈，20 mL乙酸及2 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（10 mg/mL）加入到1000 mL水中，摇匀后经0.45 μm滤膜过滤。流动相B：将800 mL乙腈，20 mL乙酸及乙二胺四乙酸二钠（10 mg/mL）溶液加入到1000 mL水中，摇匀后经0.45 μm滤膜过滤。

色谱条件：色谱柱：ODS-3反相柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；紫外检测器检测波长：278 nm；进样量：10 μL；洗脱程序：0～10 min，100% A；10～25 min，100%～68% A；25～35 min，68% A；35～36 min，68%～100% A[22]。

1.2.9 茶多酚酸奶抗氧化活性测定 样品制备：向10 g酸奶样品中加入15 mL无水乙醇和0.5 mL浓盐酸，然后以3000 r/min离心10 min（4 ℃），静置10 min后取上清液进行以下体外抗氧化实验。

DPPH自由基清除实验：将上清液稀释200倍后，取2 mL稀释液与2 mL DPPH自由基溶液（0.1 mol/L）混匀，25 ℃条件下避光孵育30 min后，于517 nm波长下测定其吸光度，以95%乙醇作空白对照，DPPH自由基清除率的计算公式如下所示[23]。

ABTS+自由基清除实验：将上清液稀释30倍后，取0.1 mL稀释液与3.9 mL ABTS工作液混匀，25 ℃条件下反应6 min后，于734 nm波长下测定其吸光度，以蒸馏水作空白对照，ABTS+自由基清除率的计算公式如下所示[24]。还原能力的测定：将上清液稀释30倍后，取2.5 mL稀释液，与2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mmol/L，pH6.6）和2.5 mL铁氰化钾溶液（1%，w/v）混匀，50 ℃水浴20 min后迅速冷却，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%，w/v），混合后以3000 r/min离心10 min（25 ℃），取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL三氯化铁溶液（0.1%，w/v），混匀后于700 nm波长下测定其吸光度[25]。吸光度越大，则样品的还原能力越强。

1.3 数据处理

每组进行多次重复实验，所有结果均以“平均值±标准差”的形式表示。实验结果用Origin（version 8.0 for Windows，OriginLab Corporation，SPSS）软件进行统计分析，显著性差异水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对酸奶pH及可滴定酸度的影响

茶多酚浓度对酸奶的pH及可滴定酸度的影响如图1所示。

酸度的变化与酸奶的黏度、质地以及组织状态等方面密切相关。由图1可知，不同浓度茶多酚的加入对酸奶的pH（图1A）和可滴定酸度（图1B）并未产生显著影响，而酸奶的酸度主要由乳酸菌发酵产生。本研究结果表明，该浓度梯度下茶多酚的加入并未显著抑制发酵过程中乳酸菌的生长及发酵产酸[26]。

图1 茶多酚浓度对酸奶pH及可滴定酸度的影响Fig.1 Effects of TP concentrations on pH and titratable acidity of yogurt

2.2 茶多酚对酸奶营养成分含量的影响

茶多酚浓度对酸奶营养成分含量的影响如表1所示。

酸奶中各项营养成分的含量是评价酸奶质量的重要指标。由表1可知，不同浓度茶多酚的添加对酸奶的水分、脂肪、蛋白质及灰分含量并未产生显著影响，而还原糖含量有所增大，这可能是由于茶多酚的还原性干扰了测定结果，使得所测还原糖含量偏高[27]。

表1 茶多酚浓度对酸奶营养成分含量的影响Table 1 Effect of TP concentrations on nutrient content of yogurt

2.3 茶多酚对酸奶持水力的影响

茶多酚浓度对酸奶持水力的影响如图2所示。

酸奶的持水力是受酸奶中总固形物含量和总蛋白含量的影响，与产品的组织状态密切相关[28]。由图2可知，与空白对照组酸奶的持水能力相比，随着茶多酚添加量的增大，酸奶的持水力略有减小，但仍然维持在80%以上。酸奶持水力的大幅下降会严重影响产品的品质，使得其在储存过程中发生乳清析出和质量劣变等问题，缩短产品的保质期。查阅相关文献分析可知[8-9,17,28]，酸奶持水力的轻微降低对产品的品质并不会产生显著的负面影响，而植物多酚的高浓度添加会使得酸奶的持水力大幅下降，故应严格控制植物多酚在酸奶中的添加剂量。在本研究中，含有不同浓度（0.1～0.5 g/100 mL牛乳）茶多酚的酸奶在设定的储存周期内（15 d）并未发生乳清析出等不良现象，表明该浓度剂量下茶多酚的添加对产品的储存品质并未产生负面影响。此外，相关研究表明，茶多酚的加入可能会促使蛋白聚集形成大分子聚集物，使得酸奶的内部结构发生改变，从而改变蛋白质分子与水分子间的相互作用，降低蛋白质对水分子的吸附与控制作用，进而使得持水力下降[8]。

图2 茶多酚浓度对酸奶持水力的影响Fig.2 Effect of TP concentrations on the water-holding capacity of yogurt

2.4 茶多酚对酸奶质构特性的影响

茶多酚浓度对酸奶硬度、黏性、胶粘性和内聚性的影响如图3所示。

质构特性是衡量酸奶品质的一个重要指标，酸奶的口感、组织状态及质量稳定性都与之密切相关[29]。由图3可知，茶多酚的添加使得酸奶的硬度（图3A）、黏性（图3B）和胶粘性（图3C）整体呈下降趋势，而对其内聚性（图3D）并未产生显著影响。查阅相关文献可知，酸奶发酵过程中，茶多酚与牛乳中的酪蛋白分子发生相互作用，可引起酪蛋白分子之间的聚集，干扰了酸奶内部网状部结构的形成，从而使得酸奶的硬度和黏性值下降[30]。实际加工和销售中，过高的硬度和黏性对于酸奶的感官品质有负面影响，会降低消费者对产品的接受程度。因此，适量浓度茶多酚的添加，可以使得凝固型酸奶的质地更为柔软，降低其对容器的黏附性，在一定程度上提升其感官品质。

图3 茶多酚浓度对酸奶质构特性的影响Fig.3 Effect of TP concentrations on texture of yogurt

2.5 茶多酚对酸奶颜色的影响

茶多酚浓度对酸奶颜色的影响如表2所示。

酸奶的颜色是感官评价的重要参考指标，影响着消费者的食欲和总体接受程度。由表2可知，随着茶多酚浓度的增加，ΔL值逐渐下降，而Δa值、Δb值和ΔE值逐渐增大，这与茶多酚本身的棕红色颜色相关。研究结果表明，适量茶多酚的添加会赋予酸奶一定的色泽，使之呈现出淡淡的茶汤色，增加产品的市场竞争力[31]。

表2 茶多酚浓度对酸奶颜色的影响Table 2 Effect of TP concentrations on the color of yogurt

2.6 酸奶风味成分的分析

酸奶中风味成分的种类和含量与酸奶的感官评价密切相关[32]。由表3可知，酸奶中的挥发性风味成分主要包括酸类、醛类、酮类、醇类和其他类化合物。分析可知，茶多酚的加入降低了酸奶中酸类物质的相对含量，增多了其它风味物质的含量和风味物质的总类别数。这可能是由于茶多酚具有良好的反应活性，参与了酸奶发酵过程中相关风味成分的生成反应，从而影响了风味物质的组成及比例[15]。同时，茶多酚还可能通过对酸奶中益生菌相关代谢途径的调控，间接地对酸奶的风味产生影响。研究结果表明，茶多酚的添加可以丰富酸奶的风味，对于改善酸奶风味和提高酸奶品质具有积极影响。

表3 茶多酚（0.1 g/100 mL牛乳）对酸奶风味成分的影响Table 3 Effect of TP (0.1 g/100 mL milk) on flavor components of yogurt

2.7 茶多酚中主要儿茶素单体含量的变化

通过高效液相色谱法对茶多酚酸奶中四种儿茶素单体（EC，EGC，ECG及EGCG）进行分析，结果如图4～图6所示。

图6 茶多酚酸奶（0.5 g茶多酚/100 mL牛乳）的高效液相色谱图Fig.6 High performance liquid chromatography of yogurt with 0.5 g TP/100 mL milk

图4为儿茶素混合标品的高效液相色谱图，结合《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313-2018）中儿茶素类测定的结果可知[22]，实验所用混合标品中按照保留时间依次出现的物质为EGC、EC、EGCG和ECG。

图4 混合标准溶液高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatography of mixed standard sample

图5为未经发酵处理的茶多酚的高效液相色谱图。由图可知，实验所用的茶多酚中含有四种儿茶素，且各自的含量分别为1.27%（EGC）、1.86%（EC）、60.83%（EGCG）和24.78%（ECG），EGCG为茶多酚中含量最高的儿茶素成分，这与相关报道和测定一致[5,22]。

图5 茶多酚溶液（1 mg/mL）的高效液相色谱图Fig.5 High performance liquid chromatography of TP solution(1 mg/mL)

图6是茶多酚酸奶中茶多酚的高效液相色谱图。由图6可知，在乳酸菌的发酵作用下，茶多酚中四种主要儿茶素单体的相对含量都发生了变化，分别为2.92%（EGC）、1.61%（EC）、39.64%（EGCG）和20.16%（ECG）。同未经发酵的茶多酚相比（图5），酯型儿茶素（EGCG和ECG）的相对含量降低。分析可知，酯型儿茶素结构中的酯键在酶的作用下不稳定，易发生水解。酸奶发酵过程中，益生菌的生长代谢会产生多种酶，它们在适宜的发酵温度条件下可能对酯键产生水解效应，故而使得酯型儿茶素在共发酵过程中结构发生了改变，酯键被破坏，使其降解生成分子量更小的物质[33]。

2.8 茶多酚酸奶抗氧化活性的分析

茶多酚酸奶和未经发酵的茶多酚牛乳的抗氧化活性如图7所示。

图7 茶多酚酸奶和未发酵的茶多酚牛乳的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of TP yogurt and TP milk

由图7未添加茶多酚的空白对照组可知，未添加茶多酚的牛乳（即茶多酚浓度为0 g/100 mL）不具有抗氧化活性，而牛乳经保温发酵形成酸奶后，其抗氧化活性相比未发酵牛乳的略有增加，但并不显著，该结果表明牛乳发酵产物所提供的抗氧化活性较低，而茶多酚的添加能够赋予牛乳和酸奶更强的抗氧化活性。同时，随着茶多酚添加浓度的增大，茶多酚酸奶和茶多酚牛乳的DPPH自由基清除率（图7A）和ABTS+自由基清除率（图7B）逐渐提高，呈显著的浓度剂量效应。此外，随受试浓度的增加，反应溶液的吸光度值也在逐渐增大（图7C），表明其还原能力逐渐增强。结合前述实验结果可知，茶多酚虽然与酸奶中的蛋白质结合并在发酵过程中受到益生菌相关酶的作用发生了降解，但其仍能展现出较强的抗氧化活性（图7）。同时，与同浓度未经发酵的茶多酚牛乳的抗氧化活性结果相比，茶多酚酸奶的DPPH及ABTS+自由基清除能力总体上并没有发生显著的变化，其还原能力增强，表明由益生菌的生长代谢所促发的茶多酚中酯型儿茶素的降解并未对茶多酚的抗氧化能力产生显著的负面影响，这可能是由于酯型儿茶素（ECG和EGCG）降解所得的小分子物质仍然具有良好的电子转移能力，从而表现出良好的还原能力与自由基清除作用[31,33]。因此，乳酸菌发酵所得的茶多酚酸奶仍然具有良好的抗氧化能力。实验结果表明，茶多酚牛乳发酵所得的酸奶仍具有良好的抗氧化活性。

3 结论

添加茶多酚对酸奶的pH、可滴定酸度、持水力及营养成分含量影响不大。同时，茶多酚的添加改善了酸奶的质构特性和颜色，提升了酸奶的风味。此外，茶多酚中的酯型儿茶素在发酵过程中会发生显著的降解，但茶多酚酸奶仍具有良好的自由基清除活性及还原能力等抗氧化作用。实验结果表明，茶多酚对酸奶的品质及功能性有益，可作为一种天然成分参与酸奶的制备。研究为茶多酚在酸奶加工领域的应用提供参考。后续还需要进一步优化和确定茶多酚在酸奶中添加的工艺参数，并对其在乳酸菌发酵过程中的降解历程及对其抗氧化作用影响的构效关系和相关分子机理进行研究。