响应面法优化鹿鞭肽酶解工艺及体外补肾健骨活性分析

赵峻露，李春楠，尹馨雪，兰 梦，张 辉，李晶峰

（长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林长春 130117）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种全身代谢性骨病，以低骨量和骨组织微结构破坏为其显著特征[1]。近年来，随着世界人口老龄化的日益加剧，OP发病率逐年上升，目前已成为中老年人最常见的疾病之一[2-3]。中医认识OP的历史由来已久，多将其归属为“骨痿”、“骨痹”的范畴。中医认为肾精亏虚是骨质疏松发生的主要病机，认为“肾藏精，主骨，生髓”，骨为肾所主，肾气的盛衰影响骨的生长、发育、强盛、衰弱的过程，因此补肾中药被广泛应用于骨质疏松的防治[4-5]。

鹿鞭（Penis et Testis Cervi）系鹿科动物梅花鹿、马鹿的干燥带睾丸的阴茎，是我国传统名贵动物药，具有补肾精、壮肾阳、强腰膝的功效[6]。鹿鞭可以做成药膳和药酒，通过食疗来改善身体状况以及加强体质[7]。并且鹿鞭酒拥有悠久历史，补肾益精效果显著，在我国广为流传[8]。随着人们对鹿鞭的重视和应用，现今已经形成了与其他珍贵药材配伍制成复方用于保健食品和产品的市场趋势[9-10]。鹿鞭具有广泛的生物活性及药理作用，其单方或与其他中药配伍均可发挥强健滋补、补肾壮阳等作用[11-13]。康樱樱等[14]研究发现梅花鹿鞭提取物能明显延长小鼠负重游泳时间，具有明显的抗疲劳作用。谭兴贵等[15]研究3种不同鞭类药材对肾阳虚动物的壮阳作用，鹿鞭作用效果最好。鹿鞭还含有多种化学成分，其中含有丰富的蛋白、肽类成分[16]。近年来，研究表明动物源生物活性肽具有丰富的生物学活性和极高的可食用安全性，添加此类物质的功能性食品可以用来预防或调节慢性病，具有广阔的发展前景[17-19]。目前生物活性肽已经成为当下研究的热点，其常见的提取方法有化学水解法、微生物发酵法、酶解法等[20]。其中酶解法条件温和，水解程度易调控，制备得到的肽类成分具有高生物活性和低毒副作用的特性，深受研究者的喜爱[21]。然而鹿鞭肽类活性成分研究尚浅，其提取工艺及主要药理作用更是鲜有研究报道。因此，积极深入地研究鹿鞭活性肽的开发和其药理作用，对鹿鞭今后在保健食品、医药等领域的新应用具有重要意义。

本实验以梅花鹿鹿鞭为原料，超声波提取法获得鹿鞭蛋白，采用碱性蛋白酶酶解，以水解度为指标，单因素实验结合响应面法优化鹿鞭肽的酶解工艺，并对TM3细胞及MC3T3-E1细胞的相关活性进行研究，在细胞水平上探讨鹿鞭肽补肾健骨的作用，为鹿鞭肽的制备工艺以及进一步的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

梅花鹿鹿鞭（干燥品） 吉林省东鳌鹿业科技开发有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；茚三酮 上海三爱思试剂有限公司；小鼠睾丸间质细胞TM3、小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；DMEM/F12（1:1）培养基、α-MEM培养基 美国HyClone公司；胎牛血清 美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK8） 北京博奥森；地塞米松 索莱宝；小鼠睾酮ELISA检测试剂盒、骨钙素ELISA检测试剂盒 美国Rad公司；BCA试剂盒 中国碧云天；ALP试剂盒 中国南京建成；其他试剂 均为国产分析纯。

METTLER TOLEDO pH计 上海虹益仪器仪表有限公司；KS-250DE超声波清洗器 洁力美超声仪器有限公司；DF101-S磁力加热搅拌器 金坛市水北康辉实验仪器厂；Alpha 1-2 LDplus冷冻干燥机

德国Christ公司；CKX41倒置显微镜 日本奥林巴斯公司；Model680酶标仪 日本Takara公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鹿鞭蛋白制备 取鹿鞭干品，砍成2 cm左右小块，粉碎过20目筛，按料液比1:14（g/mL）溶于水中，于功率300 W下超声提取1 h[22]，以3600 r/min离心20 min，取上清液过滤，冷冻干燥，即得鹿鞭蛋白冻干粉，备用。

1.2.2 鹿鞭肽酶解工艺 参考王帅等[23]比较不同蛋白酶水解鹿鞭制备活性肽的研究结果，本实验选用了碱性蛋白酶进行水解。称取一定量的鹿鞭蛋白冻干粉，按底物浓度1% 加入一定量的蒸馏水，置于恒温磁力搅拌器中搅拌，调节酶解温度及pH，加入碱性蛋白酶水解，水解过程中不断加入1 mol/L NaOH或HCl以维持pH恒定在所需值，水解结束后转入沸水中煮沸15 min，灭酶，冷却至室温，以3600 r/min离心20 min，取上清液冷冻干燥，即得鹿鞭肽冻干粉，备用。

1.2.3 鹿鞭肽酶解工艺优化

1.2.3.1 单因素实验 实验选用碱性蛋白酶，以水解度为指标，考察酶解温度、pH、酶用量和酶解时间4个因素对实验水解效果的影响。酶解固定条件设为温度50 ℃、pH9、酶用量1200 U/g、时间5 h，各因素梯度分别为酶解温度：40、45、50、55、60 ℃；pH：8.5、9.0、9.5、10.0、10.5；酶用量：400、800、1200、1600、2000、2400 U/g；时间：3、4、5、6、7 h。

1.2.3.2 响应面试验设计 结合单因素实验结果，按照Box-Behnken试验设计原理，以水解度为指标，选取酶解温度、pH、酶用量和酶解时间4个因素为优化对象，进行四因素三水平的响应面试验设计，采用软件Design-Expert V12.0.11分析设计，试验因素水平如表1所示。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 水解度的测定 按照茚三酮比色法[24]测定水解度，得到标准曲线回归方程：y=1.8327x-0.0163，R2=0.9949，利用标准曲线得到蛋白质量，并按下列公式计算水解度（DH）：

式中：A表示供试品溶液（样液）中的蛋白质量，mg；W表示称样质量，mg；V1表示水解液的总体积，mL；V2表示显色时所用稀释液的体积，mL。

1.2.5 鹿鞭肽对TM3细胞存活率和睾酮分泌量的影响

1.2.5.1 细胞培养 将冻存的TM3细胞复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养，当细胞贴壁时，吸去培养液，用PBS洗3次至无漂浮细胞，加入含10%胎牛血清的培养基继续培养。待细胞长至培养瓶80%～90%时，进行传代培养，隔2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.5.2 CCK8法测定细胞存活率 以每孔4×103个细胞接种于96孔板，随机分为空白组、模型组和给药组，培养24 h，细胞模型组和给药组加入5 μmol/L过氧化氢[25]造模4 h后，细胞给药组分别加入终浓度为12.5、25、50、100、200 μg /mL样品，每组5个复孔，在培养箱中继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，37 ℃避光孵育4 h，在酶标仪450 nm处检测各组OD值。根据所测得吸光度，计算每组细胞存活率，计算公式如下。

1.2.5.3 睾酮含量测定 TM3细胞给药培养24 h后，吸取上清液。采用小鼠睾酮ELISA试剂盒检测睾酮含量，按照说明书操作，于450 nm 测定OD值。

1.2.6 鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞存活率和ALP活力、OCN分泌量的影响

1.2.6.1 细胞培养 将冻存的MC3T3-E1细胞复苏后，用含10%胎牛血清的α-MEM培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养，后续操作同1.2.5.1。

1.2.6.2 CCK8法测定细胞增殖活性存活率 以每孔4×103个细胞接种于96孔板，随机分为空白组、模型组和给药组，培养24 h，MC3T3-E1细胞模型组和给药组加入100 μmol/L地塞米松[26]造模24 h后，后续操作同1.2.5.2。

1.2.6.3 ALP活力测定 MC3T3-E1细胞给药培养24 h后，弃去培养基至于冰上，PBS洗3次，每个孔中加入200 μL RIPA裂解液，使裂解液覆盖满细胞，裂解30 min后，4 ℃条件下12000 r/min离心30 min，取上清液测定蛋白浓度，具体方法按照BCA法蛋白定量试剂盒说明，按ALP试剂盒操作测定ALP活力。

1.2.6.4 OCN含量测定 MC3T3-E1细胞给药培养24 h后，吸取上清液。采用骨钙素ELISA试剂盒检测OCN含量，按照说明书操作，于450 nm测定OD值。

1.3 数据处理

每组实验分别进行3次独立的重复实验，结果取平均值，应用Design Expert 12.0.11对响应面试验结果进行分析；应用SPSS 22.0软件进行数据的显著性分析，计量数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶解温度对鹿鞭肽水解度的影响 由图1可知，随着酶解温度的升高，鹿鞭肽水解度先升高后降低，在50 ℃时水解度达到最高值29.95%，显著高于其他样品组，表明在50 ℃时碱性蛋白酶的酶活性最好（P＜0.05）。超过50 ℃呈明显下降趋势，这是由于温度继续升高，蛋白酶结构遭到破坏而导致酶活性降低甚至丧失，从而使酶解效率降低[27]。因此确定酶解温度45～55 ℃为宜。与贾斌等[28]利用碱性蛋白酶水解鹿尾肽获得的最适温度范围结果一致。

图1 酶解温度对水解度的影响Fig.1 Effect of enzymatic temperature on degree of hydrolysis

2.1.2 pH对鹿鞭肽水解度的影响 pH对水解度的影响表现在对酶活性的影响，碱性蛋白酶最适pH范围在9～11。如图2所示，随着pH升高，水解度先升高后显著降低，pH为9.0时水解度达到最高值30.07%（P＜0.05）。这是由于酶作为蛋白质的一种，其酶促反应速率和pH关系密切，酶具有最适pH，当 pH偏离最适值时会影响酶的天然构象和与底物的解离程度，使酶活性受到抑制甚至失活[29]。汪涛等[30]研究了利用碱性蛋白酶酶解鹿皮蛋白的最适pH，发现pH为9时达到最佳，与本实验结果一致。因此选择酶解最适pH范围8.5～9.5。

图2 pH对水解度的影响Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.3 酶解时间对鹿鞭肽水解度的影响 由图3可知，水解度随着时间延长先升高后降低最后趋于平缓，在反应4 h时水解度达最高值36.24%，发现此时水解度显著高于其他样品组（P＜0.05）。郅慧等[31]利用碱性蛋白酶酶解鹿筋胶原蛋白时，酶解时间影响水解度的趋势与本实验相似。这是由于当酶解时间较短时，酶与底物反应还不够充分，此时肽键快速断裂，酶解速率较快，随着时间的延长，酶与底物结合达到饱和状态，继续延长时间会使酶解产物浓度增加，从而产生竞争性抑制作用，酶解反应速率减缓[32]。因此选择酶解时间3～5 h。

图3 酶解时间对水解度的影响Fig.3 Effect of enzymatic time on the degree of hydrolysis

2.1.4 酶用量对鹿鞭肽水解度的影响 如图4所示，随着酶用量的增加，水解度先升高后降低，当酶用量为1200 U/g时水解度达最高值35.56%，相比于其他酶用量有显著性差异（P＜0.05）。这与高冷等[33]研究利用碱性蛋白酶酶解鹿血肽的单因素实验结果相一致，均在1200 U/g时水解度达最高值。这是由于酶量的增加可以提高底物与酶的作用，从而加快酶解速率，当底物已经充分酶解时，继续增加酶用量体系流动性会变差，从而导致反应速率呈现下降趋势[31]。因此选择酶用量800～1600 U/g。

图4 酶用量对水解度的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面模型的建立与分析 根据单因素实验结果，选取的响应面试验因素为酶解温度（A）、pH（B）、酶用量（C）、酶解时间（D），以水解度（Y）为响应值，根据Box-Behnken中心组合原理，设计试验优化鹿鞭肽酶解工艺，响应面试验设计及结果见表2。

运用 Design-Expert 12.0.11软件对表2的数据进行二次多元回归分析，得到鹿鞭肽水解度（Y）预测值对自变量A、B、C和D的回归方程：Y=39.59+0.5083A-4.73B+1.01C-0.3741D-0.9766AB+3.71AC+0.1633AD+1.93BC-3.35BD+2.03CD-3.17A2-4.84B2-5.35C2-3.64D2，方差分析结果见表3。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回归模型显著性检验及方差分析Table 3 Significant test and variance analysis for the regression model

从方差分析结果可知，二次多项式回归模型项极显著（P＜0.001），失拟项不显著（P＞0.05），表明试验误差小，操作可行，试验结果与模型拟合度好。由F值可知，各因素的影响大小为B（pH）＞C（时间）＞A（温度）＞D（酶用量），一次项、二次项及交互项的方差分析显示，C、BC、CD对Y的影响高度显著（P＜0.01），B、AC、BD、A2、B2、C2、D2对Y的影响极显著（P＜0.001）。模型的决定系数R2=0.9790，校正决定系数R2Adj=0.9580，表明由响应面试验设计所获得的回归方程与实际情况拟合较好，可用此模型进行预测及分析[34]。

2.2.2 响应面交互作用分析与优化 利用Design Expert 12.0.11软件做不同因素间响应曲面图与等高线图，响应曲面坡度和等高线的形状及紧密程度可直观地反映各因素间交互作用和对响应值的影响程度。响应曲面坡度越陡峭说明研究因素对结果影响越大，等高线呈圆形说明交互作用不显著[35]。响应曲面图和等高线图见图5。

由图5响应曲面坡度陡峭程度可知，酶解温度与酶用量曲面坡度较为平缓，说明二者对水解度影响较弱，pH与酶解时间曲面坡度变化陡峭，说明二者对水解度有显著影响。由图5等高线形状及紧密程度可知，图5a等高线密集但呈近圆形，图5c呈圆形，说明AB、AD因素之间交互作用不明显，图5b、图5d、图5e、图5f等高线较密集且呈椭圆形，说明AC、BC、BD、CD因素之间交互作用对响应值的影响显著。

图5 各因素交互作用的响应曲面和等高线图Fig.5 Response surfaces and contour plots of factor interactions

2.2.3 验证实验 通过软件Design Expert 12.0.11求解方程，计算得到水解度达到最大值时的最优酶解工艺条件为：酶解温度51.24 ℃，pH8.71，时间4.12 h，酶用量1301.85 U/g，水解度预测值41.03%。为了便于进行试验，对该条件进行修正：酶解温度51 ℃，pH8.7，时间4.1 h，酶用量1300 U/g。该条件下进行三次重复验证实验，取平均值，得鹿鞭肽水解度为40.36%±0.22%，与预测值相接近，为鹿鞭蛋白的酶解提供了良好的技术支撑。

2.3 鹿鞭肽对TM3细胞存活率和睾酮分泌量的影响

2.3.1 鹿鞭肽对TM3细胞存活率的影响 当代中医认为肾阳虚证与性腺轴的功能紊乱密切相关[36]，TM3细胞作为研究雄激素合成与分泌、及生精细胞调控的理想细胞模型，可以真实的模拟药物对体内雄激素的影响[37]。不同浓度鹿鞭肽对TM3细胞存活率的影响结果见图6。H2O2诱导TM3细胞的模型组与空白组相比，细胞存活率极显著下降（P＜0.001），表明TM3细胞肾阳虚模型造模成功。与模型组相比，给药组在12.5～200 μg/mL质量浓度范围内均不同程度地促进TM3细胞增殖，且呈现浓度依赖性，在200 μg/mL质量浓度下促进作用最强，存活率达85.97%，与模型组有极显著差异（P＜0.001）。但在12.5 μg/mL浓度下，给药组与模型组无显著影响（P＞0.05）。

图6 不同浓度鹿鞭肽对TM3细胞存活率的影响（x±s，n=3）Fig.6 Effects of different concentrations of deer whip peptide on the survival rate of TM3 cells（x±s, n=3）

2.3.2 鹿鞭肽对TM3细胞睾酮分泌量的影响 慢性肾病的一个主要影响是由于性腺功能减退引起的睾酮水平降低[38]。TM3细胞是雄性动物合成和分泌睾酮的唯一细胞，而睾酮是维持精子发生和雄性性征不可或缺的激素[39]。通过2.3.1结果可知，在质量浓度为12.5 μg/mL时，鹿鞭肽对TM3细胞无明显促进作用，故对25～200 μg/mL鹿鞭肽进行睾酮分泌量分析。如图7所示，与空白组相比，模型组睾酮分泌量极显著降低（P＜0.001），表明TM3细胞肾阳虚模型造模成功。与模型组相比，给药组均可不同程度地增加TM3细胞的睾酮分泌量，当质量浓度为50 μg/mL时，睾酮分泌量达到最高，此时分泌量为42.47 ng/mL，极显著高于模型组（P＜0.001）。

图7 不同浓度鹿鞭肽对TM3细胞睾酮分泌量的影响（x±s，n=3）Fig.7 Effects of different concentrations of deer whip peptide on the amount of testosterone secreted by TM3 cells（x±s, n=3）

上述结果表明，鹿鞭酶解肽能够提高TM3细胞存活率以及促进睾酮分泌，并且在质量浓度为50 μg/mL时，鹿鞭肽促进细胞睾酮分泌量达到最多，效果最佳。因此推测鹿鞭肽能够通过促进睾酮分泌从而影响性腺轴功能，间接调节肾功能，具有一定的补肾活性。

鹿鞭酶解肽促进睾酮分泌的最佳浓度为50 μg/mL，与对细胞存活率的最佳浓度200 μg/mL不一致，推测是因为鹿鞭肽对TM3细胞产生的增殖作用不仅仅是通过促进睾酮分泌来发挥药效，可能同时通过其它途径来促进TM3细胞的存活率。

2.4 鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞存活率和ALP活力、OCN分泌量的影响

2.4.1 鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞存活率的影响 成骨细胞的动态功能失调可导致骨质疏松，MC3T3-E1细胞是成骨样细胞前体细胞，具有在体外分化成成骨细胞、骨细胞，形成骨结节的能力，是体外研究药物对成骨细胞活性影响的理想细胞模型[40]。不同浓度鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞存活率的影响结果见图8。地塞米松诱导MC3T3-E1细胞的模型组与空白组相比，细胞存活率极显著下降（P＜0.001），表明MC3T3-E1细胞骨质疏松模型造模成功。与模型组相比，给药组在12.5～200 μg/mL质量浓度范围内均不同程度地促进MC3T3-E1细胞增殖，且呈现浓度依赖性，在200 μg/mL质量浓度下促进作用最强，存活率达106.93%，与模型组有极显著差异（P＜0.001）。但在12.5 μg/mL浓度下，给药组与模型组差异不明显，对MC3T3-E1细胞存活率无显著影响（P＞0.05）。

图8 不同浓度鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞存活率的影响（x±s，n=3）Fig.8 Effects of different concentrations of deer whip peptideon the survival rate of MC3T3-E1 cells（x±s，n=3）

2.4.2 鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞ALP活力的影响

ALP是成骨细胞骨形成和分化的标志，在骨矿盐沉积以及骨钙化过程中比较重要，是成骨细胞的敏感指标[41]。通过2.4.1结果可知，鹿鞭肽在12.5 μg/mL时促进MC3T3-E1细胞增殖作用不显著，因此对25～200 μg/mL质量浓度的鹿鞭肽进行ALP活力测定。见图9，与空白组相比，模型组ALP活力极显著降低（P＜0.001），表明MC3T3-E1细胞骨质疏松模型造模成功。与模型组相比，各浓度给药组均可极显著提高MC3T3-E1细胞ALP活力（P＜0.001），在质量浓度为50 μg/mL时，ALP活力最强，达到6.80金氏单位/g prot。

图9 不同浓度鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞ALP活力的影响（x±s，n=3）Fig.9 Effects of different concentrations of deer whip peptide on ALP viability in MC3T3-E1 cells（x±s，n=3）

2.4.3 鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞OCN分泌量的影响 OCN是成骨细胞分化阶段的晚期指标，在骨细胞外基质中对羟磷灰石的沉积和结合起着重要的作用[42]。通过2.4.1结果可知，在质量浓度为12.5 μg/mL时，鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞无明显促进作用，故对25～200 μg/mL鹿鞭肽进行OCN分泌量分析。如图10所示，与空白组相比，模型组OCN分泌量高度显著降低（P＜0.01），表明MC3T3-E1细胞骨质疏松模型造模成功。与模型组相比，给药组均可不同程度地增加MC3T3-E1细胞OCN分泌量，当质量浓度达到50 μg/mL时，OCN分泌量达到最高，此时分泌量为15.63 ng/mL，极显著高于模型组（P＜0.001）。

图10 不同浓度鹿鞭肽对MC3T3-E1细胞OCN分泌量的影响（x±s，n=3）Fig.10 Effects of different concentrations of deer whip peptide on the amount of OCN secretion in MC3T3-E1 cells（x±s，n=3）

上述结果表明，鹿鞭酶解肽能够提高MC3T3-E1细胞存活率，并且可以有效地提高ALP活性以及促进OCN的分泌，进一步增强了成骨细胞的矿化活动，说明鹿鞭肽在成骨分化的早期以及晚期均起到了促进作用，具有一定的健骨活性。

鹿鞭酶解肽在质量浓度为50 μg/mL时，ALP活力以及OCN分泌达到最佳效果，与细胞存活率达最佳效果时浓度为200 μg/mL不一致，推测鹿鞭肽提高MC3T3-E1细胞的存活率不单纯是通过ALP活性以及OCN分泌来发挥药效，可能还通过其它途径协同作用。

3 结论

本研究以梅花鹿鹿鞭为原料，超声波法提取鹿鞭蛋白，并采用碱性蛋白酶酶解法制备鹿鞭肽，在单因素实验的基础上，结合响应面分析法对酶解条件进行优化，最终得到最佳酶解工艺条件为温度51 ℃，pH8.7，时间4.1 h，酶用量1300 U/g，此时水解度为40.36%±0.22%，与响应面试验预测值相近，具有实际应用价值，为鹿鞭肽的工业制备提供了理论基础。

通过体外构建TM3细胞肾阳虚模型和MC3T3-E1细胞骨质疏松模型，分别从“补肾”和“健骨”两个方面探究鹿鞭肽的潜在活性。结果表明，在补肾方面，与模型组相比，不同浓度的鹿鞭肽均能提高TM3细胞存活率，且呈浓度依赖性。给药后的TM3细胞上清液中睾酮含量显著增加（P＜0.05），在质量浓度为50 μg/mL时，睾酮分泌量达最高值42.47 ng/mL，证明鹿鞭肽的补肾作用与睾酮的分泌密切相关，验证了鹿鞭肽具有一定的补肾活性，但鹿鞭肽的补肾活性不仅是通过睾酮的分泌发挥效果，推测可能同时通过其它途径来促进TM3细胞增殖；在健骨方面，与模型组相比，鹿鞭肽能显著提高MC3T3-E1细胞存活率及ALP活力、OCN分泌量，在质量浓度为50 μg/mL时，ALP活力和OCN分泌量达最高值，证明鹿鞭肽的健骨作用与ALP活力和OCN的分泌密切相关，进一步验证了鹿鞭肽具有一定的健骨作用，但鹿鞭肽的健骨活性也不单纯是通过ALP活力以及OCN的分泌来发挥作用，推测可能通过其它途径协同来提高MC3T3-E1细胞存活率。综上所述，初步验证了鹿鞭肽具有良好的补肾健骨活性，具有潜在治疗骨质疏松症的能力，为以后鹿鞭产品在保健食品、医药等领域的开发应用提供新思路。其具体的作用机制和体内实验还有待进一步研究。