犬源皮氏葡萄球菌的分离鉴定和耐药性分析

李虹瑾，唐玉娇，刘嘉琳，刘 斌，董文龙

(1.长春科技学院职业技术学院，吉林 长春 130600 ； 2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118 ； 3.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132109)

宠物犬作为人类忠实的伙伴，已成为很多家庭的伴侣动物。然而，由于犬只本身免疫低下或是宠主的不科学喂养，常导致宠物犬感染致病性细菌而发病。本试验在1只患有外耳炎的金毛犬耳道拭子样品中分离到1种凝固酶阴性葡萄球菌，并对分离菌株进行了鉴定和药物敏感性分析。

1 材料与方法

1.1 样品来源 无菌采集金毛犬外耳炎脓液样品，进行致病性细菌的分离鉴定。

1.2 主要试剂 Mueller-Hinton琼脂、脑心浸液琼脂、脑心浸液肉汤、细菌生化鉴定管和兔血浆，均购自青岛海博生物技术有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、革兰染色液，均购自北京索莱宝科技有限公司；DL2 000 DNA Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司；TaqPCR Mix 预混液、琼脂糖、无菌去离子水、50×TAE 缓冲液、溴化乙锭(EB)，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 试验药品 环丙沙星、恩诺沙星、四环素、多西环素、阿奇霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、头孢噻肟、氯霉素、庆大霉素、万古霉素、阿莫西林和磺胺间甲氧嘧啶共14种抗菌药物，均由吉林农业科技学院馈赠。

1.4 细菌的分离培养 将采集的脓液样品接种于脑心浸液琼脂平板上，37 ℃条件下恒温培养12 h，挑取单菌落于脑心浸液肉汤中摇床增殖培养至对数生长期备用。取100 mL菌液进行1 000倍稀释后涂布于脑心浸液琼脂平板上，37 ℃恒温培养12 h，观察菌落形态。

1.5 革兰染色镜检 清洁载玻片表面，采用无菌生理盐水稀释挑取的单菌落，酒精灯火焰上进行加热固定，按步骤进行革兰染色，油镜下观察菌体形态特征。

1.6 生化试验 在兔血浆安瓿瓶中加入脑心浸出液肉汤培养基0.2 mL，再加入制备的浓菌悬液 0.5 mL，(36±1) ℃培养，连续观察6 h，根据是否有凝块形成判定分离菌株是否能够产生血浆凝固酶。备用的培养菌液分别接种于葡萄糖、乳糖、甘露醇等发酵管中进行产酸生化试验。

1.7 16S rRNA基因序列分析 抽取1 mL备用菌液10 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，作为分离菌株16S rRNA基因PCR扩增的模板。参照参考文献[1]设计16S rRNA细菌鉴定通用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反应体系(25 μL)：基因组DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，TaqPCR Mix 预混液12 μL，无菌去离子水10 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对1 500 bp处目的条带进行切胶回收，送生工生物工程(长春)股份有限公司测序，将一代测序获得的基因序列进行BLAST比对分析。

1.8 系统进化分析 于GenBank数据库中下载与分离菌株16S rRNA基因序列高度同源的16S rRNA基因序列，采用MEGA 6.0软件构建系统进化树。

1.9 最小抑菌浓度(Mininum inhibitory concentration，MIC)测定及药敏试验 将菌液调整至浓度为1×106CFU/mL，抗菌药物配制成0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000、128.000、256.000 μg/mL和512.000 μg/mL 15个不同的梯度浓度，采用琼脂扩散法测定14种抗菌药物对分离菌株的MIC。药敏结果的判读参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗微生物药物敏感性试验判断标准。

2 结果

2.1 细菌的分离培养 分离菌株命名为SP-1，涂布于脑心浸液琼脂平板上培养后，可见乳白色较小菌落，边缘整齐，表面光滑，略凸起(图1)。

图1 SP-1菌落形态Fig.1 SP-1 colony morphology

2.2 革兰染色镜检 油镜下观察可见明显的革兰阳性葡萄球菌，多数菌体呈聚集状态(图2)。

图2 SP-1革兰染色结果(1 000×)Fig.2 Result of SP-1 Gram staining (1 000×)

2.3 生化试验 分离菌株SP-1不能产生血浆凝固酶，其他各项生化试验结果与 Trülzsch等[2]相关试验中皮氏葡萄球菌的生化结果基本一致(表1)。

表1 SP-1生化试验结果Table 1 Results of SP-1 biochemical test

2.4 16S rRNA基因序列分析 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约1 500 bp处有一清晰核酸电泳条带(图3)。PCR扩增产物测序结果(1 461 bp)与GenBank数据库中相关菌株序列进行比对，结果显示，SP-1与皮氏葡萄球菌的同源性为99%。

图3 分离株16S rRNA的 PCR 扩增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA of the isolateM：DL2 000 DNA Marker； 1：SP-1 16S rRNA 基因PCR扩增产物M:DL2 000 Marker; 1:PCR product of SP-1 16S rRNA

2.5 系统进化分析 选取SP-1 16S rRNA基因序列与GenBank数据库中其他来源皮氏葡萄球菌的16S rRNA基因序列构建系统进化树，结果显示，SP-1与其他来源的皮氏葡萄球菌亲缘关系均较远(图4)。

图4 SP-1 与其他来源皮氏葡萄球菌16S rRNA基因系统进化树的构建Fig.4 Construction of phylogenetic tree of 16S rRNA gene from SP-1 and other Staphylococcus pettenkoferi▲:本试验所得分离株▲：The strain isolated in this experiment

2.6 MIC测定及药敏试验 采用琼脂扩散法测定14种抗菌药物对SP-1的MIC值，药物敏感性结果显示，SP-1对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素、四环素、多西环素、头孢噻肟、庆大霉素、万古霉素和阿莫西林敏感，对林可霉素、克林霉素、阿奇霉素、红霉素和磺胺间甲氧嘧啶高度耐药(表2)。

3 讨论

凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci，CoNS)被认为是构成人类和动物皮肤及黏膜正常微生物群的主要组成部分，一般无致病作用，与临床感染关联并不密切。然而，近年来大量临床数据表明，这些凝固酶阴性葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌可引起免疫缺陷患者或新生儿不同形式的感染，如细菌性脑膜炎、鼻炎、鼻息肉、鼻窦炎、坏死性鼻窦炎、假体周围关节感染、咽炎、头颈骨髓炎、扁桃体炎、复发性扁桃体炎等[3-4]。此外，在兽医临床上具有致病性的凝固酶阴性葡萄球菌的分离率也在逐渐增多，该类细菌可引起奶牛的乳房炎、猪的呼吸系统疾病、猫的尿路感染和外耳炎等[5-7]。

表2 SP-1药敏试验结果Table 2 Results of SP-1 drug sensitivity test

皮氏葡萄球菌于2002年被鉴定为一种新的血浆凝固酶阴性葡萄球菌，该细菌是人类皮肤的共生细菌[2]。与其他血浆凝固酶阴性葡萄球菌类似，皮氏葡萄球菌很少具有致病性，但偶尔也会在免疫系统受损的患者中引起感染[8]。近年来，德国、比利时、法国、韩国、意大利、巴西和墨西哥等国家相继报道由皮氏葡萄球菌造成感染的病例，其中多数病例都是从人体血液中分离到该病原[9-10]。

2018年，印度学者首次从1只患有腹膜炎的猫体内分离到皮氏葡萄球菌，分离株对包括甲氧西林在内的36种抗菌药物耐药，分离株不能形成生物膜，但携带多个生物膜生成基因(icaA、IS257、nuc和mecA)[11]。本试验从患有外耳炎的金毛犬耳道脓液样品中分离到1株皮氏葡萄球菌，该菌株对林可霉素、克林霉素、阿奇霉素、红霉素和磺胺间甲氧嘧啶表现出高度耐药。因此，需要警惕该菌成为耐药基因的贮存库，通过人与宠物间的亲密接触，使耐药基因在对人类危害较大的致病菌中水平传播。目前，由血浆凝固酶阴性葡萄球菌引起的院内感染病例正在逐年增加，其中耐药性葡萄球菌给临床治疗带来巨大挑战[3-4]。因此有必要对皮氏葡萄球菌的致病机制和耐药机制进行深入的研究，防范该细菌对人类和动物可能造成的潜在危害。