慈莲胶囊治疗实验性乳腺增生大鼠作用研究*

王 丽 莫日根 常剑锐 于 蕾 张彩云

（内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020）

乳腺增生是女性最常见的乳腺疾病，其致病原因主要为内分泌功能紊乱[1]。慈莲胶囊为内蒙古自治区中医医院院内制剂，临床治疗乳腺增生取得了良好效果[2，3]，笔者通过研究慈莲胶囊对乳腺增生大鼠的作用，探讨其治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 70 只SPF 级雌性未孕SD大鼠（内蒙古医科大学实验动物中心提供），体质量180～220 g，生产许可证SCXK（蒙）2015-0001。

1.1.2 药物与试剂 慈莲胶囊（内蒙古自治区中医医院制剂室提供）；枸橼酸他莫昔芬片（扬子江药业集团有限公司，国药准字H32021472，10 mg× 60 片）；乳癖消片[辽宁上药好护士药业（集团）有限公司，国药准字Z21021822，0.67 g× 72 片]。

苯甲酸雌二醇注射液（杭州动物药品厂，批号：0902145，规格l mL∶l mg），黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：090601，规格1 mL∶20 mg），甲醛溶液、无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20200608、20210112）；二甲苯（天津富宇精细化工有限公司，批号：20181219），石蜡（德国徕卡，批号：202006）。雌二醇（JYM0608Ra）、孕酮（JYM0049Ra）、泌乳素（JYM1048Ra）（武汉基因美生物科技有限公司）；促黄体生成素（El absci ence 公司，E-EL-R0026c）、促卵泡激素（上海尚宝生物科技有限公司，批号：10075RA）。ELI SA试剂盒、SABC免疫组化试剂盒；DBA显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：20201022N、20200621H）；HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1020）；通用SP 检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：SP0058）。兔抗鼠雌激素受体抗体（批号：20512）、兔抗鼠孕激素受体抗体（批号：20524）、P53 抗体（批号：20556）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3 仪器 全自动染色机Lei ca Aut ostainer XL、分体式组织包埋机Lei ca EG1150 H、切片机Lei ca RM 2235、摊片机Lei ca HI 1210、烘片机Lei ca HI 1220、封闭式全自动组织脱水机Lei ca APS 200S、显微镜Lei ca DM2000 均为德国徕卡制造；恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司，XMTD-6000）；冷冻高速离心机（德国SI GMA，Si GMR3-18K）；电子天平（梅特勒-托利多，ML204/02）；精密游标卡尺（成都成量工具，0～150 mm，0.02 mm）；烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司，DHG-9140A）；载玻片（Ser vi cebi o）；盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司，10212432C）；微波炉（格兰仕，P70D20TL-P4）。美国MD Spectra Max i 3 多功能酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 造模 取70 只大鼠，适应性饲养1 周后，随机分空白组（10 只）和造模组（60 只）。造模：于大鼠后肢内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，日1次，连续25 d；然后肌肉注射黄体酮注射液5 mg/kg，日1 次，连续5 d；第31 天起，每3 d 肌肉注射1 次苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg 至给药结束。空白组大鼠肌肉注射等体积生理盐水。造模30 d 后，随机选取6 只造模组大鼠和1 只空白组大鼠处死。以造模组大鼠第2 对乳头高度和直径均显著高于空白组（P＜0.01），且病理切片观察到大鼠乳头的腺导管、腺泡、腺小叶等出现相应的病理变化，判定造模成功。

1.2.2 分组及给药 造模组造模成功后，随机分为6 组，即模型组、乳癖消组、他莫昔芬组及慈莲胶囊低、中、高剂量组，每组9 只。慈莲胶囊组按生药量计0.7 g/（kg·d）、1.4 g/（kg·d）、2.8 g/（kg·d）为低、中、高剂量；他莫昔芬组予枸橼酸他莫昔芬3 mg/（kg·d）；乳癖消组予乳癖消片0.5 g/（kg·d）；空白组及模型组均予等体积蒸馏水；均灌胃给药。给药体积为8 mL/kg，日1 次，连续30 d。

1.3 观察指标

1.3.1 乳房直径及乳头高度 用精密游标卡尺于造模前、给药前后测大鼠胸部的第2 对乳头高度和乳房直径。

1.3.2 HE 染色观察乳腺组织病理形态学变化 常规取材经固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，在光镜下观察大鼠乳腺组织病理变化。

1.3.3 酶联免疫法（ELISA）测血清中性激素水平 末次给药24 h 后，取血，离心（离心半径8.2 cm，离心速度3000 r/min，离心时间15 min）处理。依据ELI SA试剂盒说明书，测血清雌二醇（E2）、孕酮（P）、泌乳素（PRL）、促黄体生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）含量。

1.3.4 免疫组化SP 法检测乳腺组织中ER、PR、P53表达 切片脱水封片后，显微镜下观察，采集图像并分析。以细胞质和（或）细胞核内出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，采用Image-Pro Plus 软件测量棕黄色区域的积分光密度值（I OD）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0 统计学软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（）表示；各组数据均进行正态性检验，符合正态分布，组间比较采用独立样本t 检验；等级资料采用非参数检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组对乳腺增生大鼠乳房直径、乳头高度的影响 空白组大鼠乳头呈小颗粒状，贴在皮肤上，柔软，个别稍隆起。与空白组比较，模型组大鼠乳头红肿，乳房直径和乳头高度增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组乳房直径和乳头高度均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠给药前后乳头直径、高度比较 （）

表1 各组大鼠给药前后乳头直径、高度比较 （）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

2.2 各组乳腺组织形态学变化 病理组织学观察：空白组乳腺小叶、导管散在分布于脂肪组织间，无小叶腺泡增生、聚集及导管扩张。模型组乳腺小叶增生、腺泡数目明显增加，排列拥挤，导管上皮增生、管腔扩张，腺腔内可见大量分泌物，结构紊乱，呈乳腺增生性改变；相较于模型组，乳癖消组和他莫昔芬组的腺泡数量、导管上皮增生程度及腺腔扩增程度均显著降低，腺腔内分泌物明显减少，乳腺组织增生状态得到改善。与模型组相较，慈莲胶囊高、中、低剂量组乳腺腺泡数量、导管上皮增生及腺腔扩张均有不同程度降低，腺腔内分泌物减少，乳腺组织的增生状态得到了不同程度改善，其中尤以慈莲胶囊高剂量组改善显著。见图1。

图1 各组大鼠乳腺组织HE 染色图

2.3 各组对血清中E2、P、PRL、LH、FSH 影响 与模型组相比，各组大鼠E2、血清PRL、FSH水平均降低（P＜0.05）；P 水平均增高，其中他莫昔芬组、乳癖消组升高明显（P＜0.05）；血清LH 水平均显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清中E2、P、PRL、LH、FSH 含量比较 （）

表2 各组大鼠血清中E2、P、PRL、LH、FSH 含量比较 （）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

2.4 各组对乳腺增生大鼠乳腺组织切片中ER、PR、P53 表达的影响 与空白组相比，模型组的乳腺组织，呈ER阳性表达的导管上皮细胞及腺泡细胞显著增多，以胞核表达为主，为棕黄色或黑褐色，强弱不等，多呈中-强阳性（P＜0.05）。与模型组相比，乳癖消组和他莫昔芬组呈ER阳性表达的细胞显著减少，以胞核表达为主，强弱不等（P＜0.05）。与模型组相比，慈莲胶囊高、中、低剂量组乳腺组织增生状态得到不同程度改善，呈ER阳性表达的乳腺导管上皮细胞和腺泡细胞也不同程度减少，尤以慈莲胶囊高剂量组表达减少显著（P＜0.05）。

与空白组相比，模型组增生的乳腺组织，呈PR阳性表达的导管上皮细胞及腺泡细胞显著增多，以胞核表达为主，为棕黄色，强弱不等，多呈弱-中度阳性（P＜0.05）。与模型组相比，乳癖消组和他莫昔芬组呈PR阳性表达的细胞显著减少，以胞核表达为主，强度减弱（P＜0.05）。与模型组相比，慈莲胶囊高、中、低剂量组乳腺组织增生状态得到不同程度改善，呈PR阳性表达的细胞也不同程度减少，强度减弱。尤以慈莲胶囊高剂量组表达减少显著（P＜0.05）。

与空白组相比，模型组增生的乳腺组织，呈P53阳性表达的导管上皮细胞及腺泡细胞显著增多，以胞核表达为主，为棕黄色，强弱不等，多呈弱-中度阳性（P＜0.05）。与模型组相比，乳癖消组和他莫昔芬组呈P53 阳性表达的细胞显著减少，以胞核表达为主，强弱不等（P＜0.05）。与模型组相比，慈莲胶囊高、中、低剂量组乳腺组织增生状态得到不同程度改善，呈P53 阳性表达的细胞也不同程度减少，尤以慈莲胶囊中、高剂量组表达减少显著（P＜0.05）。见图2～图4。

图2 各组大鼠乳腺组织中ER 的表达

图3 各组大鼠乳腺组织中PR 的表达

图4 各组大鼠乳腺组织中P53 的表达

3 讨论

乳腺增生是女性常见、多发病，以乳腺局部肿块和疼痛为主症。患病的人群更易发乳腺癌，本实验运用的雌孕激素联合造模方法，是目前动物实验中经典的造模方法。给药期间每隔3 d 给予雌激素刺激，以保持模型的稳定性。干预后他莫昔芬组、乳癖消组、慈莲胶囊各组乳房直径和乳头高度均较模型组降低（P＜0.05）。表明慈莲胶囊能改善乳腺增生模型大鼠的乳房肿胀程度。

现代医学认为，乳腺增生的主要原因是卵巢激素紊乱导致“下丘脑-垂体-卵巢轴”失去平衡。本实验结果表明他莫昔芬组、乳癖消组、慈莲胶囊各组均能降低乳腺增生大鼠血清E2、PRL、FSH含量（P＜0.05），他莫昔芬组、乳癖消组，能升高血清P 水平（P＜0.05）。慈莲胶囊各剂量组均能不同程度地升高P 含量，但差异无统计学意义。他莫昔芬组、乳癖消组、慈莲胶囊各组均可升高血清LH水平（P＜0.05）。表明慈莲胶囊治疗乳腺增生可能是通过调节性激素水平进而引起下丘脑-垂体-卵巢轴的反馈调节乳腺增生模型大鼠异常的血清性激素水平而抑制乳腺上皮的增生或促进其复旧。

乳腺增生的发生与乳腺组织局部雌、孕激素受体的含量及敏感性增高有关。陈怡君[4]指出女性正常乳腺中的雌、孕激素受体高表达与乳腺癌的发病率升高有关。P53 是多种肿瘤相关性的一种癌基因和抑癌基因，分野生、突变2 型。野生型可促进细胞分化，抑制肿瘤增殖，是重要的调控因子。若P53 基因发生缺失或突变，则成为致癌基因。P53 已经确定在乳腺增生病中有表达，说明P53 基因可能促使增生组织向癌性组织转化或过渡，提示不典型增生恶化的信号。通过对乳腺组织中ER、PR、P53 的观察，并运用奥利德评分（Allredscore）判读系统[5]，经2 名高年资病理医师双盲法阅片取平均值。数据经统计学分析处理表明与模型组相比，他莫昔分组、乳癖消组、慈莲胶囊各组乳腺组织中ER、PR、P53 阳性表达的细胞不同程度减少，从而改善乳腺增生程度，与上述学者观点相一致。