褪黑素对荻种子萌发及幼苗生长和生理的影响

梁宇鹏，张 杰，梁晓宁，谢思敏

（1.安徽师范大学 生态与环境学院，安徽 芜湖 241002；2.安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室，安徽 芜湖 241000）

褪黑素（melatonin，MT），又名N-乙酰基-5甲氧基色胺，是一种吲哚杂环类化合物，先后在人和动物体内被发现，起到自由基清除剂和抗氧化剂的作用，可以减少机体受到的氧化损伤，且人体内的褪黑素还有调节人体的昼夜节律、延缓人体器官衰老、增强人体免疫力等作用［1］。1995年褪黑素首次在植物体内被发现，被证明能够提高愈伤组织的再生能力，影响种子萌发和植株开花时间，促进不定根的生长，延缓叶片衰老等［2］。褪黑素含有的5-甲氧基官能团和N-乙酰基结构表明其自身具有高亲脂性、亲水性以及与受体结合的特异性［3］，可以通过生物膜发挥调节作用。此外，作为合成前体与生长素相同的植物激素，褪黑素在低浓度情况下可以促进植物根和幼叶的生长，褪黑素处理过的植株可以表现出更稳定的碳代谢和氮代谢水平［4］。

荻［Miscanthus sacchariflorus（Maxim.）Benth.］作为一种C4型能源植物，属于禾本科芒属，光合效率高，营养需求低，水分利用效率高，一直被认为是一种潜在的高产生物质作物［5］，对环境的适应性强，可以在贫瘠或胁迫条件下生长，主要分布在河流流域、湖畔滩、沿海海湾和内陆低洼区，是我国固堤防土的环保型植物，也是改良重金属污染土壤和尾矿废弃地的首选物种［6-7］。一方面，荻可以作为原材料，在科学方法的处理下提供生物质能；另一方面，荻具有能源植物的生长快、抗性强、生物量大等特点，在修复污染土壤方面具有一定的社会效益、经济效益和生态效益。Aleksandra等［8］发现在不良环境下，荻的干物质含量比奇岗（Miscanthus×giganteus）等其他三种C4草本植物都高。此外，在镉胁迫、盐碱胁迫、重金属复合胁迫等逆境条件下，种植荻对土壤修复都具有重要作用［9-11］。

种子可以通过将植物胚保存在干燥和高度抵抗的状态来促进植物传播，其结构复杂［12］。成熟的种子在吸水膨胀后恢复代谢，标志着种子开始萌发，这一过程是高等植物生命周期中至关重要的发育阶段［13］，涉及一系列受内外调控的生化事件，如植物激素水平、温度和光照射。近年来越来越多的研究发现，褪黑素作为一种植物激素，对逆境胁迫下的植物有一定的缓解作用，在非生物胁迫下，褪黑素对植物种子萌发有一定的影响［14-16］，但是目前关于无胁迫条件下褪黑素对植物种子影响的研究较少。本研究以荻为实验材料，旨在研究褪黑素浸种对无胁迫条件下荻种子萌发的影响，通过对萌发指标、生长指标、叶绿素含量、脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、抗氧化酶活性和电导率等生理指标的测定和分析，得到对荻种子萌发有促进作用的最优褪黑素浓度，为获得更好的荻生长条件提供研究基础。

1 材料及方法

1.1 实验材料

供试种子于2021年12月14日采自安徽师范大学花津校区山坡，将采集到的荻穗于阳光下晾晒减少自由水后，剥离颖壳并保留颗粒饱满的种子，冻存于4℃冰箱，用于实验使用。褪黑素试剂购于麦克林官网（CAS：73-31-4），设置的褪黑素浓度分别是1、10、50、100、500μM，蒸馏水处理为对照组，记为CK。每个处理组设置6个重复。

1.2 实验设计

萌发实验开始于2022年4月16日，将颗粒饱满的荻种子分成6份，用3%的NaClO消毒10min后，用蒸馏水冲洗5~6遍直至干净，用不同的褪黑素溶液或蒸馏水浸种24h（黑暗条件，28℃）。浸种完成后再次用蒸馏水冲洗荻种子表面的褪黑素溶液，直至干净。选用8.5cm的培养皿，铺上两层滤纸，加4mL蒸馏水，不同处理组的培养皿均匀摆放100粒对应处理下的荻种子，以10×10方阵排列。统一放入光照培养箱中，昼夜的光暗比为14h/10h，温度分别是28℃和26℃。培养期间，定时加入定量蒸馏水，确保荻种子的正常生长。

1.3 测定指标及计算方法

1.3.1 萌发指标的测定以根长超过种子长或芽长超过种子的一半长度作为种子的发芽标准，在荻种子萌发后，每天的同一时间进行荻种子萌发数目的统计，计数7天后，根据下列公式分别计算荻种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数［7］。

发芽势（%）=（前4天萌发的种子总数/实验种子数）×100%；发芽率（%）=（前7天萌发的种子总数/实验种子数）×100%；发芽指数=ΣGt/Dt（Gt为第t天的发芽增值数，Dt为相应的发芽天数）；活力指数=种子发芽指数×苗高。

1.3.2 生长指标的测定待萌发第12天，用精度0.01mm的钢尺测量荻幼苗的根长和苗高，用精准天平测量幼苗的鲜重。

1.3.3 生理生化指标的测定待发芽第4天取样，用氢氧化钠滴定法测脂肪酶活性，用3，5-二硝基水杨酸比色法测定淀粉酶活性［17］，用福林酚法测定蛋白酶［18］；待发芽第14天取样测叶绿素含量［19］、相对电导率［20］、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性［21］。

1.4 数据处理与分析

数据处理SPSS 19.0软件，使用ANOVA进行分析，作图软件采用Excel 2016。

2 结果分析

2.1 褪黑素处理对荻种子萌发指标的影响

由表1可知，褪黑素对荻种子发芽势的影响显示了“低促高抑”的作用效果。随着褪黑素浓度的升高，荻种子的发芽势逐渐提高，当褪黑素浓度为50μM时，荻种子的发芽势达到最大，是对照组的1.03倍。在褪黑素浓度为500μM的时候，荻种子的发芽势受到抑制，是对照组的0.99倍。由表1可以看出，褪黑素对荻种子的发芽率、发芽指数和活力指数都具有促进作用，且随着褪黑素浓度的升高，荻种子的发芽率、发芽指数、活力指数都呈上升的趋势。当褪黑素浓度超过50μM时，褪黑素对荻种子的发芽率、发芽指数、活力指数的促进作用减弱。总体上看，当褪黑素浓度为50μM时，褪黑素对荻种子萌发的促进作用最好，此时的发芽率、发芽指数、活力指数分别是对照组的1.04、1.09、1.16倍，均与对照组之间存在显著差异。

2.2 褪黑素处理对荻幼苗生长指标的影响

由表2可知，不同浓度的褪黑素处理下的根长与对照组相比，分别是对照组荻幼苗根长的1.12、1.91、1.07、0.90、0.99倍，说明褪黑素作用于荻幼苗的根部时，低浓度褪黑素可以促进荻幼苗根部生长，高浓度褪黑素抑制荻幼苗的根部生长。其中，10μM的褪黑素处理下的幼苗根部长的最好，与100μM、500μM的褪黑素处理下的幼苗根长有显著差异，说明不同浓度的褪黑素处理对荻幼苗根部有明显差异性的作用。不同浓度褪黑素处理下的荻幼苗的苗高、鲜重相对于对照组都是增大的，其苗高分别是 对 照 组 的1.02、1.05、1.07、1.01、1.005倍，其鲜重分别是对照组的1.08、1.13、1.07、1.03、1.10倍。其中，10μM和50μM褪黑素处理下的幼苗的苗高与对照组之间均存在显著差异，说明不同浓度的褪黑素对荻幼苗的苗高有显著不同的作用。除了500μM的褪黑素以外，褪黑素处理浓度升高至10μM，荻幼苗的鲜重呈现增加趋势；随着处理浓度的继续升高，褪黑素对荻幼苗的鲜重的促进作用减弱。

表2 褪黑素处理对荻幼苗生长指标的影响Table 2 Effects of melatonin treatment on growth index of the seedlings of M.sacchariflorus

2.3 褪黑素处理对荻幼苗生理生化指标的影响

由图1可以看出，褪黑素对荻种子的α-淀粉酶活性有促进作用（除500μM褪黑素会降低α-淀粉酶活性），不同处理组的α-淀粉酶活性分别是对照组的1.01、1.18、1.18、1.22、0.88倍。其中，100μM、500μM褪黑素处理下的α-淀粉酶活性与对照组之间均存在显著差异，说明该浓度的褪黑素对荻种子的α-淀粉酶活性有增强或减弱的作用。但是仅10μM的褪黑素浓度对荻种子的总淀粉酶活性有促进作用，其余四个浓度的褪黑素均会不同程度的降低总淀粉酶活性，且不同浓度褪黑素对荻种子的总淀粉酶活性的影响相对于对照组来说均没有显著性差异（P＞0.05）。10μM褪黑素处理下的总淀粉酶活性与1μM和500μM褪黑素处理的结果之间均存在显著性差异，说明不同浓度褪黑素处理对于荻种子的总淀粉酶活性有不同的作用效果。

图1 褪黑素处理对荻种子淀粉酶活性的影响Fig.1 Effects of melatonin treatment on amylase activity of the seeds of M.sacchariflorus

由图2可以看出，不同浓度褪黑素处理的荻种子脂肪酶活性相较于对照组都是升高的，分别是对照组的1.75、3.63、3.31、2.06、1.94倍，其中，10μM、50μM褪黑素作用的效果最好，与对照组之间存在显著差异。而1μM、100μM和500μM褪黑素处理下的荻种子的脂肪酶活性与对照组之间不存在显著性，说明一定浓度的褪黑素对荻种子的脂肪酶活性有促进作用，高浓度褪黑素的作用效果会降低。

图2 褪黑素处理对荻种子脂肪酶活性的影响Fig.2 Effects of melatonin treatment on lipase activity of the seeds of M.sacchariflorus

由图3可以看出，褪黑素处理下的荻种子的蛋白酶活性相较于对照组均减弱，分别是对照组的0.26、0.86、0.67、0.59、0.68倍。除10μM以外，其他浓度的褪黑素处理均对蛋白酶活性有明显的抑制作用。其中，1μM褪黑素对荻种子的蛋白酶活性抑制效果最显著，而10μM、50μM、100μM、500μM褪黑素处理之间没有显著差异。

图3 褪黑素处理对荻种子蛋白酶活性的影响Fig.3 Effects of melatonin treatment on protease activity of the seeds of M.sacchariflorus

由表3可以看出，不同浓度褪黑素处理下的叶绿素a含量分别是对照组的1.04、1.19、1.06、1.11、1.04倍，10μM褪黑素处理下的叶绿素a含量与其他处理组（100μM除外）之间均存在显著差异；其叶绿素b含量分别是对照组的1.05、1.12、1.04、1.06、0.97倍，500μM的高浓度褪黑素会抑制叶绿素b的产生；其胡萝卜素含量分别是对照组的1.25、1.43、1.32、1.26、1.25倍，与对照组之间均存在显著差异。总体上看，10μM褪黑素对叶绿素含量的作用效果最好，与对照组之间均存在显著性差异，但是不同浓度的褪黑素对叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量的作用效果不同。

表3 褪黑素处理对荻幼苗光合色素的影响Table 3 Effects of melatonin treatment on photosynthetic pigments in the seedlings of M.sacchariflorus

由图4可知，不同浓度的褪黑素处理均能提高荻幼苗体内的SOD活性，分别是对照组的1.04、1.17、1.03、1.06、1.12倍。除50μM处理组之外，其他浓度褪黑素处理组与对照组之间均存在显著性差异（P＜0.05），其中，10μM褪黑素处理下的荻幼苗体内的SOD活性最强，且与其他各处理组之间均存在显著性差异。

图4 褪黑素处理对荻幼苗SOD活性的影响Fig.4 Effects of melatonin treatment on SOD activity of the seedlings of M.sacchariflorus

由图5可知，在一定范围内，不同浓度褪黑素处理均可以提高荻幼苗体内的POD活性，分别是对照组的POD活性的1.09、1.25、1.54、1.05、1.11倍。10μM、50μM的褪黑素处理下荻幼苗的POD活性与对照组之间均存在显著性差异，说明本实验中10μM和50μM褪黑素对荻幼苗的POD有影响，且50μM褪黑素处理下荻幼苗的POD活性与其他处理组之间均存在显著性差异，说明50μM褪黑素处理能够最好的提高荻幼苗的POD活性。

图5 褪黑素处理对荻幼苗POD活性的影响Fig.5 Effects of melatonin treatment on POD activity of the seedlings of M.sacchariflorus

由图6可知，低浓度的褪黑素处理对荻幼苗的CAT活性有促进作用，但是高浓度的褪黑素会表现出抑制作用，各处理组的CAT活性分别是对照组的1.12、1.54、1.21、0.58、0.55倍。随着褪黑素浓度的升高，CAT活性逐渐增强，直至褪黑素浓度为10μM时，CAT活性达到最大；随着褪黑素浓度继续升高至50μM，褪黑素对荻幼苗CAT活性的增强效果减弱；当褪黑素浓度达到并超过100μM时，荻幼苗体内的CAT活性减弱。

图6 褪黑素处理对荻幼苗CAT活性的影响Fig.6 Effects of melatonin treatment on CAT activity of the seedlings of M.sacchariflous

由图7可以看出，不同浓度的褪黑素处理下的相对电导率分别是对照组的0.89、0.81、0.74、0.87、0.87倍，说明不同处理对细胞损伤程度相对于对照组来说都有所降低，褪黑素能一定程度的缓解外界环境对细胞破坏的程度。其中，50μM褪黑素处理下的荻幼苗的相对电导率与对照组之间存在显著差异，说明50μM褪黑素可以显著减缓细胞被破坏的程度。

图7 褪黑素处理对荻幼苗相对电导率的影响Fig.7 Effects of melatonin treatment on relative conductivity of the seedlings of M.sacchariflorus

3 讨论

种子萌发过程作为植物生命周期中的一个重要阶段，其萌发指标、生长指标、生理指标等可以反映植物种子的生长情况。通过本实验萌发指标的数据结果可以发现：随着褪黑素浓度的升高，荻种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数逐渐升高，当褪黑素浓度为50μM时，荻种子萌发的促进效果最好，这一结果与Wen等［22］的研究结果一致。发芽指数可以表示发芽速度［23］，随着浓度的升高，发芽指数越大，说明该处理下的种子萌发的越快，本实验与Xiao等［24］的实验结果一致，发现低浓度的褪黑素对荻种子的萌发指数有明显的促进效果。Cao等［25］的研究结果表明褪黑素浸种处理下的玉米（Zea maysL.）种子的发芽势和发芽率均比对照组高，但是不存在显著性差异。而本实验中，不同处理组的发芽势不存在显著差异，但50μM褪黑素处理下的发芽率存在显著差异，可能是因为褪黑素在种子萌发的前期发挥的调节作用较小，随着萌发天数的增加，不同物种的种子体内的物质种类和含量不同，导致褪黑素对不同物种的种子的信号调节也有所不同，从而呈现出不同的萌发效果。

种子萌发过程需要有足够的营养物质提供，主要来自单子叶植物的胚乳。随着种子的萌发，植物进行呼吸作用，消耗干物质，因此淀粉酶活力增强，将淀粉水解成单糖［26］，为植物生长提供能量。Bai等［27］经过实验发现施加外源褪黑素可以促进淀粉水解和种子呼吸，从而提高棉花种子萌发和幼苗生长。10μM褪黑素处理下的荻种子体内α-淀粉酶和总淀粉酶活性均是最高，对荻幼苗的根长、鲜重的作用效果最好，说明此褪黑素浓度有利于荻种子的萌发和幼苗的生长。而Li等［28］发现施加200μM褪黑素可以提高镉胁迫下的二色补血草（Limonium bicolor）种子的淀粉酶含量，促进种子萌发。说明不同植物需要褪黑素的处理浓度不同，需要进行针对性实验设计。蛋白酶在细胞中可以调节蛋白质的循环和降解，将蛋白质水解成氨基酸和肽，提高生物利用率［29］，但本实验发现褪黑素处理下的荻种子体内的蛋白酶活性均低于对照组，但是脂肪酶活性和低浓度褪黑素处理下的淀粉酶活性高于对照组，说明不同植物种子萌发阶段消耗不同的酶的种类，而荻种子在萌发阶段主要通过淀粉酶和脂肪酶提供萌发必需的营养物质。

淀粉酶可以将荻种子胚芽中的淀粉水解成单糖，随着种子的萌发，胚芽中的营养物质逐渐被消耗，此时荻幼苗需要更多的能量物质。在这一过程中，叶片吸收光能，通过光合作用将CO2等无机物质转化成糖类有机化合物。其中类胡萝卜素作为辅助色素，将收集到的光能传递给叶绿素a和叶绿素b等主要色素，由叶绿素参与光化学反应，提供氧化还原反应的化学能。本实验中，10μM褪黑素处理下的胡萝卜素含量最高，说明该处理组的幼苗收集光能的能力更强。此外，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均是最高，说明该处理组的幼苗将光能转化成化学能的能力最强。

植物在不受到外界胁迫条件的情况下，自身也含有一定量的活性氧。活性氧含量过多时，会导致质膜选择透过性因膜脂过氧化而改变或丧失，破坏膜结构，打破细胞的渗透平衡［30］。本实验发现，10μM和50μM褪黑素处理下的荻幼苗的电导率较小，即其质膜损伤程度较低，且与对照组之间存在显著差异。且SOD、POD、CAT作为常见的抗氧化剂，其中SOD作为一类金属酶，可以清除超氧阴离子自由基，减弱连锁反应造成的生物损伤［31-32］；POD可以催化H2O2氧化抗坏血酸等还原性物质，清除H2O2、保护酶蛋白、促进植物细胞木质素的形成等。龙国辉等［33］也发现POD可以通过调节木质素的合成，促进植物细胞的次生壁增厚，从而达到保护细胞的目的；而CAT可促使H2O2分解成分子氧和水［34］。本实验的结果显示在低浓度褪黑素处理下（10μM和50μM），SOD、POD和CAT的含量都有所升高，10μM褪黑素处理下的抗氧化酶分别是对照组的1.17、1.25、1.54倍，均存在显著差异，50μM褪黑素处理下的抗氧化酶分别是对照组的1.03、1.54、1.21倍。此时荻幼苗体内的抗氧化能力增强，清除活性氧的能力增强，从而降低质膜的膜脂过氧化的程度。说明低浓度的褪黑素能够通过调节抗氧化酶活性调节膜脂过氧化程度，从而促进荻种子的萌发指标和幼苗的生长指标的提高。但是随着处理浓度的升高，待褪黑素浓度超过一适宜值之后，会对植物产生毒害作用，减弱抗氧化酶活性，褪黑素的促进效果减弱或对荻种子和幼苗有抑制作用。在褪黑素浓度≥50μM时，SOD活性随着褪黑素浓度的升高而升高，推测可能是在高浓度褪黑素下，超氧根阴离子通过哈伯·韦斯反应，在Fe2+/Cu2+的条件下生成羟自由基，减弱SOD将超氧根阴离子催化成H2O2。

褪黑素作为一种植物激素，且与生长素的合成前体一样，都是色氨酸，因此具有与生长素类似的性质，例如可以促进植物生长。本实验设置的褪黑素处理浓度中，10μM和50μM褪黑素对萌发指标、生长指标和生理指标的促进效果最好，对荻种子萌发和幼苗生长最有利。其中10μM褪黑素对荻幼苗的根长、苗高、鲜重有促进作用。在陈莉等［35］的实验中发现10μM褪黑素对棉花幼苗的生物量和胚根长的效果较好，这与本实验得到的结果一致，说明10μM褪黑素可以促进植物种子的萌发及幼苗的生长。

4 结论

（1）低浓度的褪黑素可以促进荻种子萌发和生长，高浓度的褪黑素抑制荻种子的萌发和生长或促进效果减弱。其中，10μM和50μM褪黑素对荻种子萌发和荻种子的促进效果较好，10μM褪黑素的综合促进效果最好，可以用于后续研究在一定浓度下的褪黑素对重金属胁迫下的荻幼苗的缓解作用。

（2）在10μM或50μM褪黑素处理下，荻种子的淀粉酶、脂肪酶活性升高，荻幼苗的叶绿素含量、类胡萝卜素含量最高，抗氧化酶活性最强，细胞的质膜损伤程度最小。这些数据从植物生理方面解释了在一定浓度褪黑素处理下，荻种子的萌发情况和幼苗的生长情况。