十枣汤凝胶膏剂HPLC法含量测定研究

黄 群，林 珊，陈 丹

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

十枣汤由芫花（Genkwa Flos）、大戟（Euphorbiae Pekinensis Radix）、甘遂（Kansui Radix）和大枣（Ju⁃jubae Fructus）组成，是治疗悬饮证的经典名方。其中芫花、大戟、甘遂为君药［1］，具有攻逐脏腑胸胁之积水的功效，大枣为佐药，能够缓解药力和毒性［2］，临床上主要用于治疗胸膜炎、恶性肿瘤、肺结核等各种病证引起的胸腔积液、肝硬化腹水等［3-6］。中医临床也有将甘遂、大戟、芫花三药粉末等量用醋调后外涂肚脐、膻中穴，治疗中晚期肿瘤患者恶性胸腹水，达到泻水逐饮、消除胸腹水的效果，但需要在临用前调制生药，不仅黏着性差、污染衣物，还易感染。因此，为改善临床患者用药的依从性，增加载药量，提高本方的治疗作用，课题组将十枣汤方改剂研制成凝胶膏剂，并针对方中君药的指标性成分芫花素和大戟二烯醇［7］，采用高效液相色谱法，建立十枣汤凝胶膏剂中芫花素和大戟二烯醇的含量测定法，为十枣汤凝胶膏剂质量控制以及后续的体外释放及透皮吸收特性等研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT液相色谱仪、SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱均购自日本岛津公司；FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药 十枣汤凝胶膏剂（实验室自制，批号：20220322、20220323、20220325）；大戟二烯醇对照品（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS010984，纯度＞98%）；芫花素对照品（批号：R13A8F33981，纯度＞98%）、卡波姆940（批号：Y10M9S55485）、无水柠檬酸（批号：S23A11H111907）均购自上海源叶生物科技有限公司；聚丙烯酸钠（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10849764）；甘羟铝（宿迁华夏生化科技有限公司，批号：20180116）；高岭土（批号：20191119）、甲醇（色谱纯，批号：20200217）、乙腈（色谱纯，批号：20200303）均购自国药集团化学试剂有限公司；甲酸（色谱纯，上海麦克林生化有限公司，批号：64-18-6）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 十枣汤凝胶膏剂的制备 称取处方量的芫花、甘遂和大戟，加入6倍量85%乙醇，浸泡，回流提取，合并滤液，浓缩，制得十枣汤浸膏。分别称取适量卡波姆940、三乙醇胺溶液，搅拌，调pH为6～7，呈透明凝胶状，作为A相；分别称取聚丙烯酸钠、甘油、高岭土和十枣汤浸膏，搅拌，混合均匀，作为B相；分别称取甘羟铝、柠檬酸、蒸馏水，使分散均匀，作为C相。C相加B相再加A相，搅拌成黏稠的半固体状，均匀涂布于无纺布上，膏体重量约为14～16 g/片，厚度约为1 mm，即得十枣汤凝胶膏剂。

2.2 色谱条件

2.2.1 芫花素测定 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.8%冰醋酸（65∶35），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长338 nm，进样量10 μL。

2.2.2 大戟二烯醇测定 Neptune C8色谱柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸（86∶14），流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。

2.3 溶液制备及测定

2.3.1 芫花素对照品溶液 取芫花素对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL含芫花素0.09 mg的芫花素对照品溶液，即得。

2.3.2 大戟二烯醇对照品溶液 取大戟二烯醇对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1mL含大戟二烯醇0.20 mg的大戟二烯醇对照品溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液 取十枣汤凝胶膏剂3片，揭去聚乙烯薄膜，剪碎，混匀，精密称取约5 g，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定重量，浸泡40 min，超声处理30 min，冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。

2.3.4 芫花素阴性对照溶液 制备缺芫花的十枣汤凝胶膏剂，按“2.3.3”项下同法操作，即得。

2.3.5 大戟二烯醇阴性对照溶液 制备缺甘遂和京大戟的凝胶膏剂，按“2.3.3”项下同法操作，即得。

2.3.6 测定法 分别取对照品溶液、供试品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰的峰面积，外标法计算含量。

2.4 专属性试验 分别精密吸取芫花素对照品溶液、供试品溶液和芫花素阴性对照溶液各10 μL，按照“2.2.1”项下色谱条件测定；分别精密吸取大戟二烯醇对照品溶液、供试品溶液和大戟二烯醇阴性对照溶液各10 μL，按照“2.2.2”项下色谱条件测定。结果表明阴性对照无干扰，提示方法专属性良好。结果见图1～图2。

图1 十枣汤凝胶膏剂中芫花素的高效液相色谱图

图2 十枣汤凝胶膏剂中大戟二烯醇的高效液相色谱图

2.5 标准曲线制备及线性关系考察 分别精密吸取芫花素系列对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，以芫花素色谱峰的峰面积（Y1）为纵坐标，进样量（X1）为横坐标，线性回归，得标准曲线方程为Y1＝6.221×106X1＋2.118×104（r＝0.999 8），表明芫花素在0.09～1.35 μg范围呈良好的线性关系。分别精密吸取大戟二烯醇系列对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，以大戟二烯醇色谱峰的峰面积（Y2）为纵坐标，进样量（X2）为横坐标，线性回归，得标准曲线方程为Y2＝9.932×105X2＋6.760×104（r＝0.999 9），表明大戟二烯醇在0.20～4.00 μg范围呈良好的线性关系。结果见表1。

表1 标准曲线制备及线性关系考察结果

2.6 精密度试验 精密吸取芫花素对照品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱峰峰面积，计算RSD，结果芫花素色谱峰面积的RSD值为0.92%。精密吸取大戟二烯醇对照品溶液，照“2.2.2”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱峰峰面积，计算RSD，结果大戟二烯醇色谱峰面积的RSD值为1.29%，说明仪器精密度良好。结果见表2。

表2 精密度试验结果

2.7 重复性试验 取十枣汤凝胶膏剂（批号：20220322），分别平行制备6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，计算芫花素含量和RSD；照“2.2.2”项下色谱条件测定，计算大戟二烯醇含量和RSD。结果芫花素的平均含量为0.069 4 mg/g，RSD值为1.67%；大戟二烯醇的平均含量为0.126 2 mg/g，RSD值为1.99%。提示方法重复性良好，结果见表3。

表3 重复性试验结果

2.8 稳定性试验 取十枣汤凝胶膏剂供试品溶液，于第0、2、4、6、8、10、12 h，分别按照“2.2.1”和“2.2.2”项下的色谱条件测定，记录芫花素和大戟二烯醇色谱峰的峰面积，计算RSD。结果表明：芫花素色谱峰峰面积RSD值为1.59%；大戟二烯醇色谱峰的峰面积RSD值为1.62%。提示供试品溶液在室温下放置12 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的十枣汤凝胶膏剂（批号：20220322）约2.5 g，共12份。其中6份精密加入芫花素对照品，制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件测定，计算芫花素的平均回收率和RSD；另6份精密加入大戟二烯醇对照品，制备供试品溶液，按照“2.2.2”项下的色谱条件测定，计算大戟二烯醇平均回收率和RSD。结果表明：芫花素的平均回收率为96.28%，RSD值为0.92%；大戟二烯醇平均回收率为97.69%，RSD值为2.37%。提示该方法准确度良好，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果

2.10 样品含量测定 分别取3批凝胶膏剂，按“2.3.3”项下同法操作制备供试品溶液，每批3份，分别按“2.2.1”“2.2.2”和“2.3.6”项下色谱条件及测定法，测定制剂中芫花素和大戟二烯醇的含量。结果表明：制备的十枣汤凝胶膏剂中芫花素及大戟二烯醇的平均含量稳定，该法可用于凝胶膏剂的质量控制。结果见表5。

表5 十枣汤凝胶膏剂含量测定结果

3 讨 论

3.1 代表性成分的选择 十枣汤凝胶膏剂是课题组改剂研制的中药经皮给药制剂，成分复杂，因此建立合理的含量测定方法，是定量控制十枣汤凝胶膏剂质量的基本保障。十枣汤方中大戟、芫花、甘遂均为君药，能攻逐全身各部水饮内结实证，制成凝胶膏剂等外用后，已避免了胃肠道不适等不良反应，故处方中减去了大枣。由于芫花主要含有芫花素等黄酮类药效成分［5-7］；大戟起利尿和泻下作用的主要药效成分是三萜类成分，其中大戟二烯醇的含量较高［5，8］；甘遂主要有效成分属于二萜类和三萜类成分，其中大戟二烯醇的含量较高［5，8］，且2020年版《中华人民共和国药典（一部）》［9］芫花项下测定的指标成分为芫花素，大戟和甘遂均以大戟二烯醇含量作为测定指标。故实验选择十枣汤凝胶膏剂的主要药效成分芫花素和大戟二烯醇作为指标性成分代表，通过HPLC法建立含量测定法，有效控制十枣汤凝胶膏剂质量。

3.2 供试品溶液的制备 十枣汤凝胶膏剂中药效成分的水溶性较差，但在甲醇中溶解度较好，故实验选择甲醇作为供试品溶液制备的提取溶剂；预实验曾比较了凝胶膏剂剪碎后是否预先浸泡后提取及浸泡时间，结果表明甲醇浸泡40 min后再提取，药效成分含量测定结果较高且稳定；供试品溶液的提取法曾比较了回流提取法4 h与超声处理法30 min，结果表明指标性成分芫花素及大戟二烯醇的含量差异不大，考虑到含量测定的时间效率，故选择超声处理法；比较15、30、45 min超声提取时间，结果表明30 min提取的指标性成分含量与45 min相当，基本提取完全。故供试品溶液制备最终确定以甲醇为溶剂，浸泡40 min后，超声提取30 min的方法。

3.3 色谱条件的优化 预实验结果表明：芫花素在338 nm波长处、大戟二烯醇在210 nm波长处具有最大吸收，可作为检测波长。参照2020年版《中华人民共和国药典（一部）》［9］，凝胶膏剂中芫花素含量测定，以十八烷基硅烷键合硅胶（C18）为固定相，甲醇-0.8%冰醋酸（65∶35）为流动相；曾考察了以C18为固定相分离凝胶膏剂中大戟二烯醇，但其色谱峰与相邻峰的分离度偏低，峰形不佳，经优化筛选，需采用辛烷基硅烷键合硅胶（C8）为固定相，并在流动相中加入少量的磷酸、甲酸等改善峰形和分离情况，最终确定以乙腈-0.1%甲酸（86∶14）为流动相测定大戟二烯醇含量；当设定柱温30 ℃时色谱分析结果更为稳定。方法学考察结果表明：所建立的十枣汤凝胶膏剂中芫花素和大戟二烯醇HPLC含量测定方法的准确度、精密度等均符合定量分析的要求，适用于十枣汤凝胶膏剂的质量控制，同时也为凝胶膏剂后续的透皮吸收行为的进一步研究奠定了基础。