巴豆叶对脑缺血再灌注模型大鼠海马CA3/DG区ERK5通路的影响*

潘佐泱，贾孟辉，，牛颖，贾戌生，马玉玮，李占涛，刘倩，岳云

1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004； 2.银川市第一人民医院，宁夏 银川 750001；3.三原县医院，陕西 三元 713800； 4.宁夏回族自治区海原县中医医院，宁夏 海源 755299

缺血性脑血管病(ischemic ceebral vascular disease，ICVD)是最常见的脑血管疾病，占所有脑血管疾病的70%[1]，具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、治愈率低的临床特点。近年来，ICVD相关患者数量持续高增长[2]，成为一个紧急的医疗和社会问题。再灌注是ICVD最主要的治疗手段之一，但会导致脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[3]。研究表明，海马神经元细胞凋亡是造成CIRI后神经元损伤的关键因素[4]，抗凋亡蛋白可能是神经保护剂的潜在靶点。细胞凋亡可被丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号转导通路的胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5)调控，ERK5也称为大MAPK，是最近发现的MAPK家族成员[5]。巴豆叶出自《南宁市药物志》，为云南省哈尼族的惯用药[6]。傣族名方“雅麻哈比扎哈聋”中用三种巴豆叶(毛叶巴豆叶、关叶巴豆叶、巴豆叶)治疗中风偏瘫、头痛等[7]，且巴豆叶为其常用的单味药物。研究显示，巴豆叶提取物可降低细胞氧化损伤，还可通过抑制炎症反应和氧化应激，减轻脑细胞损伤，从而保护神经细胞免受缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)的伤害[8]。本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)模型，以尼莫地平[9]为阳性对照药物，通过考察巴豆叶对大鼠脑组织ERK5信号通路蛋白的影响探讨其对CIRI的脑保护作用及相关机制，以期为CIRI的预防和治疗提供新型药物。

1 材料

1.1 动物SPF级3～4月龄SD雄性大鼠216只，体质量(230±20) g，由宁夏医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK(宁)2019-0001。所有大鼠饲养在温度(25±1) ℃及湿度(50±10)%的动物房内，光暗周期12 h/12 h，自由进食和饮水，适应性饲养7天后进行实验。

1.2 药物与试剂巴豆叶(宁夏医科大学第二附属医院药剂科)；尼莫地平片(拜耳医药保健有限公司，规格：30 mg×20片，批号：H20203010)。RIPA裂解液(北京索来宝科技有限公司，货号：R0020)；ECL发光试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、伊红染色液、DAB显色液、EDTA抗原修复液(10X)、PBS、Mayor′苏木素染色液、分化液(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：sc-2048、ZB-2301、ZB-2305、ZLI-9613、PV-8000、GL1100、P5368-10PAK、ZLI-9620、YY16041)；PVDF膜(美国Millipore公司，货号：IPVH00010)；二甲苯、无水乙醇、95%乙醇(天津市永大化学试剂有限公司，货号：M003921、HB15-AR-01KG、H380970)；TUNEL试剂盒(瑞士罗氏公司，批号：C1091)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司，货号：10004160)；兔抗ERK5抗体(上海泽叶生物科技有限公司，批号：74f0374)；兔抗p-ERK5抗体(上海泽叶生物科技有限公司，货号：AF8146)；水合氯醛(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20200414)。

1.3 仪器BP310P型称量天平(德国Sartorius公司)；centrifuge 5417R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司，离心半径：8.62 cm)；MDF-U72V型超低温冰箱(日本SANYO公司)；THM#50132369型超纯水仪(北京康铭泰克科技发展有限公司)；DS-11 型核酸蛋白定量仪(美国丹诺尔Denovix公司)；DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；WSE-4040型半干转膜仪系统(ATTO公司)；TS-8型转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)；3122000.060型移液器(德国Eppendorf公司)；V19型扫描仪(日本EPSON 公司)；科迪KD-TK 摊烤片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；SW.TFG-15型生物安全柜(广州瑞智净化设备有限公司)；CX31型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；RM2245型切片机、LEICAEEG1150C型自动包埋机(德国LEICA公司)；PHY-3型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备分别精密称取巴豆叶6 g、12 g、18 g，按传统煎煮法[10]煎煮，巴豆叶切碎，置于煎器中，加蒸馏水浸没药材，浸泡1 h时后，保持微沸一定时间，分离煎出液。将药渣依法煎出数次(一般为2～3次)，合并药液，并浓缩至100 mL，浓度分别为0.06 g·mL-1、0.12 g·mL-1、0.18 g·mL-1，即为巴豆叶低、中、高剂量，将所得浓缩药液按组标记好后4 ℃保存。将尼莫地平片研末，生理盐水配制为浓度1.08 g·L-1的溶液。

2.2 大鼠分组、造模及药物干预按随机数字表法将216只大鼠分为假手术组、模型组、尼莫地平组及巴豆叶高、中、低剂量组，假手术组大鼠颈动脉分离后清创缝合即可，不行插线结扎操作，其余组大鼠采用Longa线栓法[11]制备大鼠MACO模型，具体方法如下：大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，仰卧固定，消毒，沿颈中线剪开皮肤约2 cm，钝性分离筋膜及肌肉组织，剥离左侧颈总、颈外及颈内动脉，在颈总动脉靠近三者分叉5 mm处剪一缺口，插线约16～18 mm，结扎固定，缝合，清创。自插线完成即刻计时，缺血2 h后，拔线至有阻力，剪去外露部分，清创缝合，消毒。造模过程中保证大鼠置于干净恒温的笼盒，随时监测其生命体征，苏醒后单独饲养观察。造模完成的大鼠采用Zea Longa评分法[12]对模型成功与否进行 评判，其中1～3分予以纳入，0分及4分予以剔除。在进行脑缺血再灌注模型制备前30 min，各组大鼠分别给予1次相应药物灌胃，其中，假手术组及模型组以同等体积的蒸馏水灌胃。造模完成后，分别于每天同一时间点进行灌胃，灌胃体积为10 mL·kg-1，每天2次，连续灌胃6 d。

2.3 神经功能评分给药1 d、3 d、7 d后，每组取12只大鼠，采用Garcia JH评分法[13]对大鼠神经功能进行评分并记录，总分为18分。每组SD大鼠的评分结果均为六项测试分数的总和，除假手术组外，大鼠神经功能评分加和超过15分的予以剔除，使其神经功能评分控制在3～15分，且评分越高，神经功能恢复程度越好，反之则越差。

2.4 HE染色观察神经元细胞形态苏木精-伊红染色法涂染切片，电镜下观察细胞形态。给药 1 d、3 d、7 d后，每组取12只大鼠，麻醉后固定大鼠，暴露胸腔，裸露心脏，于心尖迅速插入灌注针约1～2 μm，入左心室内后固定针头，剪开右心耳，以最大流速进行生理盐水灌注，同时观察大鼠肝、肺脏器逐渐变白，直至右心耳流出澄清液体，立即更换4%多聚甲醛持续灌注，观察大鼠四肢从剧烈抽动直至僵硬、且尾巴呈崩直状态时结束灌注，分离颅骨，剖取色白质韧的全脑组织。对大鼠脑组织进行石蜡包埋、切片(厚5 μm)，经二甲苯脱蜡后，按100%、95%、90%、80%、70%梯度酒精至水进行洗脱；苏木素染液染色1～2 min；用分化液分化数秒后水洗；返蓝液返蓝至细胞核呈蓝色后水洗；伊红染色液染色10 min后进行水洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察，拍照，存档。

2.5 TUNEL检测细胞凋亡情况给药1 d、3 d、7 d 后，每组取12只大鼠，麻醉后取脑组织。取脑组织切片(厚约5 μm)，65 ℃烤片4.5 h；二甲苯脱蜡，梯度(100%、95%、90%、80%、70%)乙醇洗脱至水；Proteinase K工作液32 ℃反应20 min；PBS漂洗2次，每次5 min；待玻片干后，加50 μL TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μL荧光素标记的dUTP液)于切片上，加封口膜在黑暗湿盒中37 ℃反应1 h；加50 μL converter-POD于标本上，加封口膜在黑暗湿盒中37 ℃反应30 min；滴加100 μL DAB显色液，反应1 min，显微镜观察至有阳性显色立即终止；苏木素复染5 s后立即水洗；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，运用光学显微镜(10×40)观察大鼠海马组织CA3/DG区细胞凋亡情况并拍照记录。

2.6 免疫组化法检测脑组织ERK5蛋白表达情况给药1 d、3 d、7 d后，每组取12只大鼠，麻醉后取脑组织。取脑组织石蜡切片，常规脱蜡至水；将切片置于乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)抗原修复液，微波炉加热至沸腾，室温冷却5 min后，加热3 min，自然冷却至室温；滴加5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭液，37 ℃孵育30 min，滴加ERK5 一抗(稀释比例为1：50)，4 ℃孵育过夜。37 ℃复温30 min后，滴加生物素标记羊抗兔IgG二抗(稀释比例为1：50)，37 ℃ 孵育30 min；滴加链霉卵白素+辣根酶标记生物素，37 ℃ 孵育30 min，PBS清洗3次，每次 5 min；滴加DAB显色液工作液，显微镜下观察以控制反应时间，水洗后滴加Mayor′苏木素复染，室温孵育 2 min，水洗；中性树胶封片后采用显微镜(10×40)观察ERK5蛋白阳性表达情况并拍照记录。

2.7 Western Blot检测海马组织ERK5、p-ERK5、p-ERK5/ERK5蛋白表达水平给药1 d、3 d、7 d后，每组取12只大鼠，麻醉后取脑组织，置于冰上迅速剥离海马组织。取海马组织加入300 μL RIPA裂解液，充分混匀，4 ℃裂解2 h，12 000 r·min-1离心10 min，取上清备用；测定蛋白浓度；10% SDS-PAGE 电泳分离；转于 PVDF 膜上，转膜 35 min，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入ERK5、p-ERK5、β-actin一抗(稀释比例为1：1 000)，4 ℃反应过夜；室温复温后，加入二抗(稀释比例为1：3 000)，室温孵育90 min；PBS 清洗曝光，以 β-actin为内参，用Image J软件扫描作条带灰度值分析，对海马组织相关蛋白相对表达水平定量分析。

2.8 统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。实验数据采用两因素多水平析因设计资料的方差分析。数据需符合随机、正态性、方差齐的条件，若数据满足总体方差齐性，采用双向分组方差分析；若不满足，则进行数据变换后，再次进行方差分析，仍用双向分组方差分析；组间多重比较时，使用SNK-q检验进行组间的两两比较。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能评分比较在相同给药时间下，与假手术组比较，模型组和各干预组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各干预组大鼠神经功能评分均显著升高(P<0.01)；与巴豆叶低剂量组比较，巴豆叶中、高剂量组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01)；与巴豆叶中剂量组比较，巴豆叶高剂量组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01)。除假手术组外，各组大鼠评分均随着干预时间显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较 分)

3.2 HE染色结果模型组大鼠神经细胞均出现不同程度的核固缩、核体不规则、细胞间隙增大、间质水肿、核质排列不清等细胞损伤；各药物治疗组均能不同程度的修复神经细胞损伤，且随着巴豆叶浓度的增加，干预时间的延长，大鼠脑组织神经元细胞形态改善越明显，尤以巴豆叶高剂量干预7 d的效果最明显。见图1。

注：A：假手术组；B：模型组；C：巴豆叶低剂量组；D：巴豆叶中剂量组；E：巴豆叶高剂量组；F：尼莫地平组图1 HE染色观察各组大鼠脑组织缺血侧病理形态学改变(×400)

3.3 TUNEL检测结果在相同给药时间下，与假手术组比较，模型组及各干预组大鼠海马CA3/DG区凋亡细胞计数均显著增加 (P<0.01)；与模型组比较，各干预组大鼠凋亡细胞计数均显著降低(P<0.01)；与巴豆叶低剂量组比较，巴豆叶中、高剂量组大鼠凋亡细胞计数显著降低(P<0.01)；与巴豆叶中剂量组比较，巴豆叶高剂量组大鼠凋亡细胞计数显著降低(P<0.01)；除假手术组外，模型组及各干预组凋亡细胞计数均随着干预时间延长显著降低 (P<0.01)。见表2、图2。

表2 大鼠脑缺血再灌注损伤后海马CA3/DG区 TUNEL阳性细胞计数比较

注：A：假手术组；B：模型组；C：巴豆叶低剂量组；D：巴豆叶中剂量组；E：巴豆叶高剂量组；F：尼莫地平组；图2 TUNEL检测各组大鼠海马CA3/DG区细胞凋亡计数(×400)

3.4 Western Blot检测结果在相同给药时间下，与假手术组比较，其余各组大鼠海马CA3/DG区ERK5、p-ERK5蛋白表达均显著上调(P<0.01)；与模型组比较，各药物干预组ERK5、p-ERK5蛋白表达进一步显著上调(P<0.01)；与巴豆叶低剂量组比较，巴豆叶中、高剂量组ERK5、p-ERK5蛋白表达显著上调(P<0.01)；与巴豆叶中剂量组比较，巴豆叶高剂量组ERK5、p-ERK5蛋白表达显著上调 (P<0.01)；除假手术组外，各组ERK5、p-ERK5蛋白表达在第1天至第3天呈上调趋势，第3天至第7天呈下调趋势，且差异有统计学意义(P<0.01)。见表3、图3。

注：A：假手术组；B：模型组；C：巴豆叶中剂量组；D：巴豆叶低剂量组；E：尼莫地平组；F组：巴豆叶高剂量组图3 WB 检测各组大鼠海马CA3/DG区ERK5及p-ERK5蛋白条带图

表3 WB 检测各组大鼠海马CA3/DG区p-ERK5/ERK5表达量

3.5 免疫组化检测结果在相同给药时间下，与假手术组比较，其余各组大鼠ERK5阳性细胞计数均显著上调(P<0.01)；与模型组比较，各药物干预组ERK5阳性细胞计数进一步显著上调(P<0.01)；与巴豆叶低剂量组比较，巴豆叶中、高剂量组大鼠ERK5阳性细胞计数显著上调(P<0.01)；与巴豆叶中剂量组比较，巴豆叶高剂量组大鼠ERK5阳性细胞计数显著上调 (P<0.01)；除假手术组外，其余各组ERK5阳性细胞计数在第1天至第3天呈上升趋势，第3天至第7天逐渐下降 (P<0.01)，且第1天ERK5蛋白主要在胞膜及胞核膜上表达，第3天主要出现在细胞核中，而在胞浆中逐渐减少，差异均具有统计学意义(P<0.01)。见表4、图4。

表4 免疫组化检测各组大鼠海马CA3/DG区ERK5阳性细胞计数

注：A：假手术组；B：模型组；C：巴豆叶低剂量组；D：巴豆叶中剂量组；E：巴豆叶高剂量组；F：尼莫地平组图4 免疫组化检测各组大鼠海马CA3/DG区 ERK5阳性细胞计数(×400)

4 讨论

研究发现，脑缺血损伤会逐渐向邻近细胞扩散，形成以凋亡为主要病理因素的缺血半暗区[14]，而半暗区组织损伤发展较慢，凋亡也具有高度可控性，及时恢复血流，抢救半暗带神经细胞凋亡是目前最有效的手段[15-16]。有充分的证据表明，信号分子在减轻脑IR损伤方面发挥着重要作用，特别是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)[17]。研究表明，MAPKs由四个高度保守的亚家族组成，包括ERK1/2、Jun-NH2末端激酶1/2 (c-Jun NH2-terminal kinase1/2，JNK1/2)、p38 MAPK、ERK5。其中，ERK5是近年来研究较少、相对较新的一条通路，其发挥作用遵循 MAPKs 的蛋白激酶反应链[18]，由Ras 作为上游激活蛋白，依次激活Raf(MAPK 激酶的激酶，MAPKKK)、MEK(MAPK 激酶，MAP-KK)和ERK(MAPK)，即Ras-Raf-MEK-ERK途径[19]。ERK5是细胞存活的关键因素，研究表明，缺血半暗区ERK5、p-ERK5激酶的上调在减少神经元细胞凋亡中起关键作用，有助于神经元保护[20]。实验显示，显著抑制ERK5核易位不仅能显著降低缺血后海马CA3/DG区ERK5的激活和蛋白表达水平，而且显著增加了缺血3 d后海马CA3/DG区ERK5的死亡[21]，此研究可能为CIRI后ERK5通路激活提高CA3/DG区缺血脑组织的存活提供了直接证据。

巴豆叶是大戟科植物巴豆的叶片，《中华本草》[22]及《中华人民共和国药典》[23]中均有记述，巴豆叶辛、温，有毒，归三焦、大肠经，一般随采随用，或采后晒干用，具有祛风活血、杀虫解毒的作用，可用于治疗疟疾、痹证、跌打损伤、缠腰火丹、疮癣等，常研末酒冲，或胶囊装，每次0.03～0.15 g，外用适量，煎水洗，或浸酒搽，用治冻疮，并可杀孑孓、蝇蛆，现代主要用于治疗跌打肿痛、腰肌劳损、偏瘫头痛等[24]。研究发现，巴豆叶所含的主要化合物及大量人体必需微量金属元素具有抗氧化[25]、镇痛[26]、抗炎[27]及调节血压、血糖、血脂的作用[28]。而高血压不仅仅是一种疾病，也是卒中和心肌梗死等心血管疾病最为常见的危险发病因素，有研究证实，舒张压每升高5 mm Hg，卒中病发风险可增加35%～40%[29]。佛波醇酯是巴豆叶中最主要的二萜类化合物[30]，其结构类似于蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)的生理激活剂，可以结合 PKC 的功能区，在调节细胞分裂、增殖、凋亡、炎症发生及离子通道等方面有着至关重要的生理效应[31]，这也与巴豆叶解痉止痛、祛风活血而用于头痛发热、胸闷协痛等的古记载相关联。由此可见，采用巴豆叶入药无疑对 CIRI 的防治具有深远意义。

本研究首次采用线栓法制备大鼠MACO模型评价中药巴豆叶对CIRI的保护作用，巴豆叶毒性实验结果表明，连续1周以600～1 800 mg·kg-1浓度灌胃的大鼠未出现死亡、行为异常或中毒症状，说明巴豆叶在此浓度范围内对大鼠无毒性作用，其近似致死浓度超过1 800 mg·kg-1。本研究结果发现，模型组大鼠出现精神萎靡、神经功能严重缺损症状，表现为进食状况差，舌体紫暗，形体消瘦，被毛脏乱干结，活动迟缓，反应迟钝，对侧肢体无力，甚向对侧旋转或倾倒等症状，也可见 Honer′s 征；其脑组织病理学形态表现为神经元结构松散、排列紊乱、轮廓不完整；同时海马CA3/DG区神经元细胞大量死亡，神经元密度显著降低，出现胞核萎缩、染色质分割成块或边缘化的细胞形态；但7 d后，模型大鼠神经功能损伤症状有轻度减轻的现象，表明CIRI后，机体具有一定的自愈能力，这可能与CIRI后ERK5通路被激活有关。巴豆叶提取物干预后，上述指标均随着干预浓度和时间的增加出现明显好转，表现为进食增加，舌体转为暗红，形体逐渐匀称，被毛整洁有光泽，活动及灵敏度提高；神经元结构相对紧密、排列较整齐、轮廓基本完整，核仁清晰，受损神经元数量明显减少；同时海马CA3/DG区神经元密度显著升高。对ERK5通路研究发现，CIRI 24 h后，ERK5可被持续激活，而巴豆叶干预可进一步激活ERK5蛋白激酶，尤以巴豆叶高剂量干预7 d效果显著，可能因该组药物所含有效成分较高且作用时间较长，两因素叠加使得作用效果最佳。ERK5的磷酸化首先在细胞浆中显著增强，至再灌注3 d后，主要出现于细胞核中，而在胞浆中逐渐减少，且胞核中ERK5蛋白磷酸化水平逐渐增加；同时ERK5蛋白表达先下降，再上升，最后逐渐下降至接近假手术组，这可能与经典的MAPK级联反应对MKK5/ERK5通路的负反馈作用有关[32]。因绝大多数ERK5位于静息细胞的胞浆中，故ERK5的部分活化和易位并没有显著影响胞浆中ERK5的总蛋白水平。本研究的结果与其他作者的相关研究[14，21，33]结果对应。

综上所述，ERK5通路的激活可能促进缺血再灌注后海马CA3/DG区神经元的存活，从而对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用；巴豆叶能进一步激活ERK5蛋白激酶，显著上调通路蛋白，有效改善大鼠再灌注后的神经功能缺损症状、修复神经元细胞损伤、减少海马CA3/DG区神经元凋亡，且效应与作用浓度和时间均成正比，这可能与巴豆叶参与调控ERK5通路的进一步激活，从而介导促进神经元细胞增殖分化，抑制海马CA3/DG区细胞凋亡的神经保护机制有关。本研究结果揭示了巴豆叶对CIRI海马CA3/DG区缺血脑组织潜在的神经保护作用，但其具体作用机制还有待于进一步的深入研究考证。