富血小板纤维蛋白联合MTA用于兔牙直接盖髓术的组织学研究

2023-01-19 08:10杨雪颜志豪刘锦胡玉萍黎淑芳
口腔疾病防治 2023年3期
关键词:组织学牙本质牙髓

杨雪, 颜志豪, 刘锦, 胡玉萍, 黎淑芳

1.柳州市人民医院,广西壮族自治区 柳州(545006); 2.右江民族医学院,广西壮族自治区 百色(533000)

直接盖髓术的目的是利用盖髓材料物理性封闭露髓点,直接与牙髓组织接触的盖髓材料同时起到消除牙髓感染和炎症的作用,保持牙髓内稳态,同时诱导露髓处钙化桥形成,最终形成钙化屏障以达到生物性封闭露髓孔的作用。富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)作为第二代血小板凝聚物,具有抑制牙髓炎症反应,刺激成牙本质细胞分化的作用[1]。而相较于单独使用PRF 或三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)来培养人牙髓细胞,PRF 与MTA 联合培养的细胞具备更高的形成牙本质的能力[2]。课题组前期研究发现,应用锥形束CT 从影像学角度观察PRF 联合MTA 促进矿化组织形成的水平与MTA 无差异,都处于较高水平[3],但牙髓组织状态、生成的钙化桥结构仍需进一步深入研究。本研究拟从组织学角度,观察炎症细胞浸润程度、钙化桥形成程度及牙髓组织变性程度,比较各组实验牙的牙髓损伤修复效果。

1 材料和方法

1.1 主要材料

低速冷冻离心机(miVac DUO,Genevac,英国);硬组织切片机(RM2016,Leica,德国);MTA(登士柏,德国);常规手术器械。3%戊巴比妥钠溶液(迈瑞达,中国);玻璃离子水门汀(而至,日本);14%EDTA 溶液(贝康,中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组 2019 年4 月22 日于实验动物中心购买32 只健康雄性新西兰兔(动物合格证号:000103292),体重2.5~3.0 kg,兔龄5 个月,随机分为4 组,即PRF+MTA 组(P+M 组)、PRF 组(P 组)、MTA 组(M 组)、空白对照组(BC 组),每组8 只,同一只兔的2 颗下颌中切牙纳入同一实验组,整个实验由两组操作人员完成,即PRF 膜制备组、直接盖髓术操作组。已通过实验动物伦理委员会的审查(审批号:20190215016)。

1.2.2 PRF 膜的制备 为排除麻醉药物对PRF 制备的影响,在麻醉前进行采血,采血完毕后立即进行动物麻醉,麻醉药物为3%戊巴比妥钠溶液,剂量为30 mg/kg。自兔耳缘静脉采血,采血量为4~5 mL,在3 000 r/min 下离心10 min,静置5 min,用无菌镊钳取凝胶状复合物,剪掉下层红细胞,剩余中间凝聚物为凝胶状PRF,将凝胶状PRF 置于2 个无菌板间轻压,制成厚度约为0.5 mm 的PRF 膜。此过程由PRF 膜制备组操作人员完成。

1.2.3 直接盖髓术操作过程 碘伏消毒牙龈,切开下颌中切牙颊侧牙龈,翻瓣,去除颊侧部分骨壁,充分暴露下颌中切牙,用006 号球钻在下颌中切牙唇面备洞至洞底透红但无渗血时,用自制直径为0.5 mm 的探针轻轻加压穿髓,生理盐水冲洗,10%NaClO 溶液棉球止血3~5 min(图1a)。

根据不同分组放置相应的盖髓剂,P+M 组:将合适大小的PRF 膜覆盖于暴露牙髓组织表面,再在PRF 膜表面及周围大部分牙本质覆盖一层MTA。P 组:PRF 膜覆盖于暴露牙髓组织表面。M组:MTA 覆盖于暴露牙髓组织及周围大部分的牙本质。BC 组:穿髓孔处不放盖髓剂。放置盖髓剂后,所有样本均用玻璃离子水门汀严密充填窝洞,严密缝合牙龈(图1b~1d)。此过程由直接盖髓术组操作人员完成。

Figure 1 Direct capping procedure of mandibular central incisors in rabbit图1 兔下颌中切牙直接盖髓术操作过程

1.3 样本HE 染色及观察

1.3.1 取材及染色 术后7 d、术后28 d 从每个实验组中随机选择4 只实验兔并处死,立即用福尔马林溶液对下颌骨进行固定,48 h 后弃固定液,分离实验牙,用14%EDTA 溶液对实验牙进行脱钙2 个月。纵向包埋,切片,厚度为4 μm,选择经过穿髓孔中心的切片进行HE 染色,光镜下进行读片,综合参考El-Din、Soliman 等[4-5]的评价标准进行分级。读片由1 名牙体牙髓病专科医师、1 名病理科医师完成,如遇意见不统一的情况,另外请1 名病理科医师给予评价,最终确认分级。

1.3.2 直接盖髓术的组织学疗效评价指标 ①炎症细胞浸润,即穿髓孔周围炎症细胞浸润程度,分为3 等级,1 为轻度炎症(无或炎症细胞散在分布),2 为中度炎症(密集或带状炎症细胞浸润),3 为重度炎症(大量炎症浸润,局灶性或大面积组织坏死)。②钙化桥形成程度,即钙化屏障覆盖范围,分为3 等级,1 为覆盖大部分牙髓暴露面(≥50%露髓区域);2 为覆盖小部分牙髓暴露面(<50%露髓区域);3 为没有钙化桥形成。③牙髓变性程度,包括牙髓结构及细胞形态,分为3 等级,1 为牙髓组织结构、细胞形态正常或基本正常;2 为成牙本质细胞层破坏,但深部牙髓组织结构基本正常;3 为牙髓失去正常组织结构,出现坏死灶。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析,多样本比较选择Kruskal-wallis 单因素ANOVA 分析法,同时进行多重比较。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

7 d 时,P+M 组有1 颗实验牙暂封物脱落,排除1 颗实验牙。28 d 时,P 组有1 只实验兔死亡,排除2 颗实验牙。最终实验样本数为61。

兔下颌中切牙正常牙髓的基本组织学的表现(图2):可见明显的成牙本质细胞层、多细胞层及髓核结构,但未见乏细胞层。

2.1 各组实验牙HE 染色结果

Figure 2 Basic histologic image of the normal pulp of the mandibular central incisors in rabbits(HE×100)图2 兔下颌中切牙正常牙髓的基本组织学的表现(HE×100)

2.1.1 P+M 组 术后7 d,穿髓孔处出现少量炎症细胞,穿髓孔稍下方见钙化桥形成,钙化桥与刺激性牙本质几乎完全相连,几乎覆盖整个穿髓孔;牙髓组织结构、细胞形态基本正常,髓腔内见炎症细胞散在分布,血管稍充血。术后28 d,穿髓孔处坏死崩解物形成,稍下方见钙化桥与刺激性牙本质完全相连,钙化桥形成覆盖整个穿髓孔;牙髓组织结构、细胞形态基本正常,髓腔内见大量钙化组织形成(图3a1、3a2)。

2.1.2 P 组 术后7 d,穿髓孔处较多炎症细胞浸润,稍下方见不规则钙化桥形成,覆盖小部分穿髓孔;牙髓失去正常组织结构,出现坏死灶,大量血管扩张,髓腔内见少量钙化组织。术后28 d,穿髓孔处见部分坏死组织、牙本质碎屑,稍向下方见较多炎症细胞浸润,几乎未见钙化桥封闭穿髓孔;但髓腔内见大量不规则钙化组织形成,牙髓组织结构不清(图3b1、3b2)。

2.1.3 M 组 术后7 d,穿髓孔处出现少量炎症细胞,钙化桥覆盖小部分穿髓孔;牙髓结构紊乱,髓腔内见大量钙化组织形成。术后28 d,穿髓孔处见部分坏死组织,稍下方见钙化桥形成,覆盖大部分穿髓孔区域;牙髓组织结构、细胞形态基本正常(图3c1、3c2)。

2.1.4 BC 组 术后7 d,穿髓孔处及髓腔内大量炎症细胞聚集分布,穿髓孔处无钙化桥形成,深部牙髓见大量钙化组织填满髓腔,细胞成分减少,血管充血明显。术后28 d,穿髓孔周围及髓腔内见大量无定形结构的坏死组织(图3d1、3d2)。

本研究各组实验牙形成的钙化桥具有相似的组织学特征,在其中选取清晰且视野较好的2 张图片以比较骨小梁、骨样牙本质、钙化桥的结构,图4a 来源于术后7 d 的BC 组,图4b 来源于术后7 d 的P+M 组。骨样牙本质具有骨小梁的特征,即骨小梁内部包埋着为卵圆形骨细胞(图4a)。本实验中,实验牙髓腔可见修复性牙本质形成,因形成的修复性牙本质内部含细胞,髓腔侧为成牙本质样细胞层,也可称为骨样牙本质(图4b);本研究中各组实验牙形成的钙化桥内部含细胞成分,周围牙本质样细胞包绕,其结构似骨样牙本质(图4b)。

2.2 各组牙髓组织学分级情况及统计学分析结果

对各组实验牙牙髓组织学分级情况进行统计学分析,术后7 d、术后28 d 各组间的差异均具有统计学意义(P<0.05)(表1),组间多重比较结果如下。

表1 各组牙髓组织学分级情况及统计结果Table 1 Overview and statistical results of histological grading of dental pulp in each group

2.2.1 炎症细胞浸润程度 术后7 d 和28 d,P+M组、M 组均较BC 组炎症细胞浸润程度轻,差异具有统计学意义(P<0.05);P+M 组与M 组炎症细胞浸润程度差异无统计学意义(P>0.05);术后28 d,P+M 组较P 组炎症细胞浸润程度轻,差异有统计学意义(P<0.05)(图5a)。

2.2.2 钙化桥形成程度 术后7 d 和28 d,P+M 组钙化桥形成程度较P 组、M 组、BC 组高,差异有统计学意义(P<0.05);术后28 d,M 组钙化桥形成程度较BC 组高,差异具有统计学意义(P<0.05);P组与M 组间钙化桥形成程度差异无统计学意义(P>0.05)(图5b)。

2.2.3 牙髓变性程度 术后7 d,P+M 组、M 组均较BC 组牙髓变性程度轻,差异具有统计学意义(P<0.05);术后28 d,P+M 组较P 组、BC 组牙髓变性程度轻,差异具有统计学意义(P<0.05);P+M 组与M组间牙髓变性程度差异无统计学意义(P>0.05);P 组与M 组间牙髓变性程度差异无统计学意义(P>0.05)(图5c)。

3 讨 论

3.1 直接盖髓术的疗效分析

PRF 由自体血制成,以自身结构为支架,能够释放多种直接密切参与细胞生长、增殖、调节炎性活动和血管生成过程的生长因子,自身可降解从而被新生的组织替代[6],已逐渐被应用于牙髓再生[7]、活髓保存[8]和根尖手术[9]等牙体牙髓临床治疗措施中。Dou 等[10]通过体外细胞学实验研究发现PRF 具有良好的生物相容性、低细胞毒性和促进人牙髓细胞增殖和分化功能,同时能提高碱性磷酸酶活性,促进矿化,具备直接盖髓材料的优良特性。但因PRF 膜湿润、易溶解吸收[11]的理化性质,PRF 作为直接盖髓材料并未广泛应用于临床,国内外的相关研究主要集中在PRF 诱导牙髓细胞/牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的能力和机制研究[12-14],PRF 用于直接盖髓术的动物实验研究却较为少见。有动物实验研究发现PRF 用于直接盖髓术时,几乎无修复性牙本质形成,且牙髓内呈现程度较重的炎症反应[15]。本研究中,P 组开髓孔稍下方可见少量钙化桥形成,炎症细胞浸润程度较BC组轻,但较M 组和P+M 组重。分析其原因,PRF 膜的降解时间最短为4 d,最长为8 d[16],其降解的同时自身释放抗炎因子转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),当PRF 膜降解后,具有一定细胞毒性的玻璃离子水门汀[17]直接与牙髓组织接触,但抗炎因子的作用与玻璃离子水门汀产生的细胞毒性起到一定中和作用,从而使得P 组的炎症细胞浸润程度较BC 组低;PRF 单独应用时,边缘封闭性较差,因此炎症细胞浸润程度比M 组和P+M 组更重。

Figure 3 Histological images of pulp in each group 7 days and 28 days after direct pulp capping of rabbit teeth图3 兔牙直接盖髓术术后7 d、28 d 各组牙髓组织学表现

Figure 4 Histological features of bone trabecula,osteodentin and calcified bridge 7 days after direct pulp capping of rabbit teeth图4 兔牙直接盖髓术术后7 d 骨小梁、骨样牙本质及钙化桥组织学表现

Figure 5 Pairwise comparisons of histological grading of dental pulp between groups图5 各组牙髓组织分级组间两两比较

MTA 是一种具有高密封性能、优良抗菌性能和良好生物相容性的生物活性材料,研究表明,与氢氧化钙相比,MTA 用于直接盖髓后形成的牙本质桥质量更高,即孔隙少,钙化桥厚,且牙髓炎症较轻[18-20]。MTA 已应用于龋源性露髓成熟恒牙的直接盖髓术,实现恒牙的活髓保存,取得较好临床效果[21-22]。本研究中,对比P+M 组与M 组,发现P+M 组炎症反应与M 组相当,但形成钙化桥的程度较MTA 组高,说明PRF 联合MTA 作为盖髓剂应用于直接盖髓术具有较高可行性。

3.2 钙化桥组织学结构特征

当修复性牙本质以较快速度形成时,成牙本质细胞常还未移行至髓腔侧就被自身分泌的牙本质基质包裹,进而被包埋在间质中,以后这些细胞变性,在该处遗留一空隙,很像骨组织,具备这样结构的修复性牙本质称之为骨样牙本质[23]。本研究实验牙穿髓孔下方形成的钙化桥的结构类似于骨样牙本质,具有类似于牙本质和骨小梁的组织学特征,钙化桥内部未出现牙本质小管样结构。本课题组发现,在构建直接盖髓术实验模型时,对牙髓组织形成一定刺激,导致实验牙深部牙髓形成大量修复性牙本质,内部多含有细胞,髓腔侧为成牙本质细胞层,组织学表现为骨样牙本质,但此修复性牙本质同样未见明显牙本质小管。而Tran等[24]发现将硅酸钙材料用于大鼠磨牙直接盖髓术时,穿髓孔处可形成结构类似于初期牙本质的修复性牙本质,可见排列紊乱的牙本质小管。这可能是由于实验动物不同造成的,兔属于啮齿动物,牙齿生长速度快,因此本研究观察到兔正常牙髓组织中未见明显乏细胞层,在外界刺激下,缺乏细胞突起的成牙本质样细胞被包埋在快速形成的间质中,最终在深部牙髓中的原发性牙本质的髓腔侧形成缺乏小管样结构的骨样牙本质,在穿髓孔下方形成了类似骨样牙本质的钙化桥。但也有研究发现,骨样牙本质或纤维样牙本质的形成先于管状牙本质的形成,当成牙本质样细胞层形成后,管状牙本质相继形成,这一序列与实验模型的物种、年龄和干预措施无关[25]。

3.3 直接盖髓术后牙髓损伤修复过程

本实验中,盖髓剂下方以钙化灶不断融合形成钙化桥的方式封闭穿髓孔,这与Suzuki 等[26]的研究有所差别,其研究发现低粘度粘结剂用于大鼠直接盖髓术时,盖髓剂下方以层层包裹式形成的牙本质桥封闭穿髓孔。光镜下观察发现,术后7 d,散在钙化灶并非出现在穿髓孔处,而是在穿髓孔稍下方生成,弥散的钙化灶逐渐融合形成钙化桥。备洞及穿髓、盖髓剂的覆盖都对实验牙牙髓造成刺激,从而激发穿髓孔周围原有的成牙本质细胞的生物活性,形成刺激性牙本质,最终钙化桥与刺激性牙本质相连以封闭穿髓孔。

在实验初期,盖髓剂与新生的钙化桥之间存在少量混合着细胞、纤维、钙化灶的组织,这三层组织类似于三明治结构,此后,钙化桥与盖髓剂之间出现少量坏死组织。可能是因为盖髓材料不断释放离子,导致夹在盖髓剂和钙化桥之间的组织处于酸碱平衡失调状态,微环境改变,同时由于缺少营养供给进一步发生变性坏死,但穿髓孔及下方区域的牙髓损伤修复的细胞来源和过程较为复杂,此推论仍需大量研究进行验证。

3.4 实验设计不足与展望

本实验尚存在一定不足,术后观察时间设置不够合理,本实验只设置了2个时间点,在术后7 d,穿髓孔下方已观察到钙化桥形成,可设置更早期并延长后期观察时间,如将观察时间设置为术后3、7、14、28、54 d,这样的设置可能更利于观察牙髓损伤修复的动态过程。

综上所述,PRF 联合MTA 应用于直接盖髓术时,牙髓炎症反应程度较轻且与MTA 相当,但形成钙化桥的能力较MTA 强,钙化桥的结构类似于骨样牙本质。但其促进钙化桥形成的动态过程不明,且盖髓材料是否会影响钙化桥形成的方式,形成方式不同是否会影响钙化桥的组织结构和直接盖髓的疗效,仍需大量研究进行探讨。

【Author contributions】 Yang X peformed the experiments, analyzed the data, and wrote the article. Yan ZH, Liu J, Hu YP revised the article. Li SF designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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