基于网络药理学探讨川芎-延胡索药对治疗腰椎间盘突出症的作用机制

赵家更，曾庆云，祝木星

（山东中医药大学，山东济南 250355）

川芎-延胡索药对选自曹贻训名老中医治疗腰椎间盘突出症的经典验方“肾痹汤”，在曹老多年治疗腰椎间盘突出的过程当中，发现其对腰椎间盘突出症的疗效显著。方中延胡索能够活血、行气、止痛，川芎则在此基础上具有祛风除湿之效。现代科学研究表明，川芎主要由挥发性油类、苯酞内酯、有机酚酸和板栗多糖等物质所构成；到目前为止，川芎中共记载有149个化合物，其已报道的生物学活性主要涉及对心血管疾病的疗效、作用于中枢神经系统的抗炎和抗氧化等功能，对细胞发炎因子和凋亡因子的控制也是川芎中表达这些生物学活性物质的主要机制[1]。延胡索所具有的各种化学成份在中枢神经网络系统、消化吸收网络系统、人体心血管网络系统和垂体肾上腺皮层网络系统中均能形成影响，从而起到镇定、抗紧张、催眠现象、止痛、抗心律失常、耐溃疡、抗缺氧性心肌等功效[2]。传统医学中，药物的配伍一般遵循君臣佐使等观念，而现代药理研究多关注于单个药物或单个成分对于相关疾病或靶点的作用。本研究利用网络药理学多层次、多角度网络结构的特点，通过分析川芎-延胡索药对的有效成分和药效靶点，进一步筛选并进行富集分析，为临床研究和应用提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 化学成分的获取与筛选 在TCMSP数据库（中药系统药理学数据库与分析平台数据库，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）中输入川芎、北紫堇等进行检索，并以生物有效利用量（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的条件，筛选出潜在的生物活性成份。

1.2 潜在有效成分对应靶点的获取与整理 从TCMSP数据库中进一步检测出川芎、北紫堇等潜在有效成分及其所对应的靶位，并于Uniprot数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中找到对应的人类基因，将其导出至Excel以备后续进行数据处理。

1.3 腰椎间盘突出症靶点获取 登录GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），并以Lumbar Disc Herniation、Lumbar Disc Protrusion、Lumbar Intervertebral Disc Protrusion和Prolapse of Lumbar Intervertebral Disc等关键词进行搜索，以获取有关腰椎间盘突出症的各种关键靶点信息，并导出至Excel中，为后期数据处理做好准备。

1.4 绘制韦恩图并获取交集靶点 运用Venny网站，通过上传川芎、北紫堇药物相对的相互作用靶位和腰椎间盘突出症的相关靶位，完成韦恩图的描绘并获得药物和患者的交集靶位。

1.5 药物-成分-疾病-靶点网络构建 通过Cytoscape软件对收集到的药品潜在活性成份和药品与患者的交叉靶位进行分类处理，形成药品-成分-病变-靶点系络图。

1.6 富集分析利用David数据库系统（https://David.ncifcrf.gov/）对交集靶基因实现go解析和KEGG解析。

2 结果

2.1 潜在有效成分筛选结果 利用TCMSP数据库进行搜索，并在以生物有效利用量（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的条件下进行筛选，川芎的化学成分组成中有7个潜在有效成分，延胡索有49个潜在有效成分，其中谷甾醇（sitosterol）是二者中共同的重复成份，故总共得到了55个潜在活性成份，即谷甾醇、槲皮素、大豆甾醇、黄连素、延胡索碱等，详见表1。

表1 川芎-延胡索药对的潜在有效成分

续表

2.2 药物、疾病交集靶点筛选 在TCMSP数据库中共发现与川芎、北紫堇等潜在活性成份对应的靶位共858个，将上述靶位信息输入Uniprot数据库中可以找到相应的人类基因；从GeneCards数据库中，搜索得到的腰椎间盘突出症相关靶位共396个，在利用Venny网站进行大数据分析之后，得出药物与病变所共同的靶位共46个，并进行韦恩图的绘制，见图1。

图1 药物-疾病靶点韦恩图

2.3 药物-成分-疾病-靶点网络图绘制 将药品活性成份和靶点网络信息输入Cytoscape软件，得到构成药品-成份-病情-靶点的网路图，见图2。图中节点分为病症、药品、药品成份、靶位，连线说明了病症、药品、药品成份和靶位之间所存在的交叉关联（其中红色六边形代表病症，绿色六边形代表药品，蓝色六边形代表药品成份，黄色圆圈代表交集靶点）。此图可以明确显示川芎-延胡索药对通过多种成分、多种靶点对腰椎间盘突出症发挥治疗作用，其中度值（Degree值及节点连线数量）最高的5种成分为：槲皮素、二氢血根碱、荷包牡丹碱、13-甲基棕榈酸酯、Izoteolin，说明这些成分为川芎-延胡索药对治疗腰椎间盘突出症的主要成分。

图2 药物-疾病-活性成分-靶点网络图

2.4 GO分析 将药物与疾病交集靶点的相关数据导入David数据库进行富集分析，以P Value≤0.05为条件筛选出靠前的分子功能、生物学过程及细胞组分，绘制成柱形图，见图3～图5。其中BP分析（图3）排名靠前的有核糖核酸聚合酶ii启动子转录正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，18个靶点，39.13%）、信号传导（signal transduction，15个靶点，32.61%）、基因表达的正向调节（positive regulation of gene expression，13个靶点，28.26%）、炎症应答（inflammatory response，13个靶点，28.26%）、细胞增殖的负调节（negative regulation of cell proliferation，13个靶点，28.26%）等生物学过程。MF分析（图4）排名靠前的有蛋白活性（cytokine activity，39个靶点，84.78%）、酶 结 合（enzyme binding，10个 靶 点，21.74%）、蛋 白 结 合（protein binding，10个 靶 点，21.74%）、细胞因子活性（cytokine activity，9个靶点，19.57%）、丝氨酸型内肽酶活性（7个靶点，15.22%）等分子功能。CC分析（图5）中排名靠前的有细胞外空间（extracellular space，26个靶点，56.52%）、细胞外区域（extracellular region，22个靶点，47.82%）、细胞溶质（cytosol，19个靶点，41.30%）、质膜（plasma membrane，17个靶点，36.96%）、细胞外外体（extracellular exosome，13个靶点，28.26%）等细胞组分。

图3 GO分析生物学过程

图4 GO分析分子功能

图5 GO分析细胞组分

2.5 KEGG通路分析 使用David数据库对川芎-延胡索药对与腰椎间盘突出症的46个交集靶点进行分析，得到P Value≤0.05的通路共84个，筛选其P Value最小的10条通路制成表格，见表2。结果显示，川芎-延胡索药对治疗腰椎间盘突出症的机制主要涉及肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）、癌症通路（pathways in cancer）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis）、百日咳（pertussis）、膀胱癌（bladder cancer）、缺氧诱导因子-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、利什曼病（Leishmaniasis）、甲型流感（influenza A）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等通路。因此，推测川芎-延胡索药对治疗腰椎间盘突出症可能与上述通路关系密切。

表2 P Value最小的10条通路

3 讨论

腰椎间盘突出症是脊柱外科的常见病之一，近年久坐、缺乏锻炼已成为现代人普遍的行为习惯，这也导致了腰椎间盘突出症发病率日益增长，患病年龄也在不断减小。腰椎间盘突出症主要表现为腰痛、下肢麻木及放射痛、肌力下降、活动受限、感觉减退等,中医学将其归为“腰腿痛”范畴，主要治疗大法为活血化瘀、行气止痛、祛风散寒、补益肝肾等。肾痹汤是曹贻训名老中医的经典验方，由芥子、独活、三七、川芎、延胡索、白术、穿山龙、黄芪、党参、全蝎、地龙、桂枝、茯苓、牛膝、丹参、当归、白芍、赤芍、续断、杜仲、槲寄生、巴戟天、狗脊、葛根、木瓜、甘草等26味中药组成。方中川芎、延胡索配伍发挥活血行气、散瘀止痛的功效，在多年的临床用药中，通过加减化裁应对不同腰椎间盘突出症病例，配合其他药物及锻炼，在保守治疗过程中疗效显著，但川芎-延胡索药对治疗腰椎间盘突出症的作用机制尚不明确。

本研究通过网络药理学方法，从川芎-延胡索药对中检索出55个有效成分，对应靶点858个，其中与腰椎间盘突出症致病靶点重合者共46个。在Cytoscape软件构成的药物-成分-疾病-靶点网络图中，共有101个节点、301个边，证明川芎-延胡索从多个靶点、利用多种成分对腰椎间盘突出症进行治疗。延胡索中的槲皮素作用于40个靶点，在所有成分中排名第一。槲皮素是一种天然的黄酮类物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保护和血糖调节等多种药理作用[3]。王业杨等[4]研究表明，槲皮素可以抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应和细胞凋亡从而减轻脊髓损伤。卢桃利等[5]研究表明，槲皮素可以促进小鼠脊髓损伤后巨噬细胞表型由M1向M2表型转变，抑制炎性因子的表达，对炎性反应的调控是其发挥神经保护作用的可能机制之一。二氢血根碱存在于多种植物的提取物中，具有广泛的药理作用。张乙涛等[6]研究表明，血根碱（sanguinarine）作为一种苯菲啶异喹啉类生物碱，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、改善肝功能及诱导细胞凋亡等作用。马宁宁等[7]研究表明，二氢血根碱通过作用于ERK2、IKKβ、JAK1、PKC，影响下游蛋白表达，阻碍抗炎信号的传递，从而发挥抗炎作用。荷包牡丹碱，别名山乌龟碱，具有阵痛、镇静等功效。郭锰等[8]研究表明，荷包牡丹碱可以抑制人肝癌MHCC97-H细胞的转移及侵袭，该作用与下调VEGF、MMP-2、MMP-9基因表达及抑制JAK2/STAT3信号通路的活化有关。汪诗卉等[9]研究表明，荷包牡丹碱在体外对胃癌细胞的增殖与生长具有抑制作用，可促进其凋亡，其作用可能与Bcl-2/Bax降低导致Caspase-3活化有关。刘岩等[10]研究表明，荷包牡丹碱能有效抑制人肺腺癌细胞A549的生长，使细胞周期阻滞在S期，进一步诱导其凋亡，并使caspase-3蛋白活化。由此可见，川芎-延胡索药对中的槲皮素、二氢血根碱、荷包牡丹碱等有效成分，具有抗炎、抗氧化、改善肝功能、抗肿瘤等功效，可能是治疗LDH的有效成分。

从药物-疾病-活性成分-靶点图上可知，前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、μ型阿片受体（OPRM1）、雄激素受体（AR）、钠依赖性血清素转运蛋白（SLC6A4）、雌激素受体蛋白（ESR1）、诱导型一氧化氮合酶（NOS2）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、缝隙连接α-1蛋白（GJA1）、原癌基因c-Fos（FOS）等可能是川芎-延胡索治疗LDH的主要靶蛋白。GO富集分析得出，川芎-延胡索药对治疗腰椎间盘突出症主要涉及核糖核酸聚合酶ⅱ启动子转录正调控、信号转导、基因表达的正向调节、炎症应答、细胞增殖的负调节、凋亡过程的负调控、转录的正向调节，DNA模板、血管生成、一氧化氮生物合成过程的正向调节、对脂多糖的细胞反应等生物学过程；涉及蛋白质异二聚活性、受体结合、蛋白质同二聚活性、染色质结合、转录因子结合、丝氨酸内肽酶活性、细胞因子活性、相同蛋白质结合、酶结合、蛋白结合等分子功能；涉及细胞外空间、细胞外区域、细胞溶质、质膜、细胞外外体、线粒体、薄膜筏、细胞表面、细胞质核周区、神经元投射等细胞组分，其过程较为复杂。

经过KEGG富集分析得出，被明显富集的信号通路共有10条。其中肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）可诱导多种细胞内信号传导，包括凋亡、细胞存活、炎症和免疫。黄蓓等[11]研究发现，TNF信号通路中的TNF-α不仅可以使其信号通路发生异常，还可以与其他促炎性细胞因子刺激破骨细胞分化和活化，而引起骨丢失，刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生降解软骨的蛋白酶，最终导致关节和软骨的破坏。张丹等[12]研究发现，HIF-1在成血管-成骨耦连反应中发挥关键作用，作为上游基因调控着体内多种成血管、成骨基因的表达，促进血管形成的同时，协同促进骨的再生。刘莉菲等[13]研究发现，HIF-1α通过直接调节多种骨组织细胞、促进骨血管生成、改变糖酵解途径等方式对骨组织的生长和重塑过程进行调控，从而对骨相关肿瘤、股骨头坏死、HO等病理过程产生重要影响。此外，癌症、恰加斯病、甲型流感等信号通路也富集了较多的基因，因此推断川芎-延胡索药对可能通过以上信号通路发挥治疗腰椎间盘突出症的作用。

综上所述，川芎-延胡索在治疗腰椎间盘突出症上具有多成分、多靶点、多途径的特点。本研究通过网络药理学的方法初步预测了川芎-延胡索治疗LDH的核心靶点，以期为进一步的分子生物学和药理学研究提供理论基础。