MAM在哺乳动物细胞中的研究进展

徐 妲，冯 鑫，李亚秋，刘思彤，潘晓燕

（吉林医药学院生殖医学中心，吉林吉林 132013）

线粒体相关内质网膜（MAM）具有独特的生化特性，显微结构表现为与线粒体紧密相连的内质网（ER）小管。MAM的功能范围从脂质代谢和钙信号传导到炎症小体形成。与这些功能一致，MAM富含脂质代谢酶和钙处理蛋白（Dimmer等，2017）。在细胞应激情况下，MAM会改变其调节蛋白组，如细胞氧化还原状态的改变，从而改变MAM的功能。在哺乳动物细胞中，MAM和线粒体之间接触位点的形成是细胞存活所必需的，包括钙从ER转运到线粒体、将磷脂酰丝氨酸从ER导入线粒体以脱羧为磷脂酰乙醇胺、形成自噬体，线粒体的形态、动力学功能以及细胞存活的调节。

1 MAM参与脂质代谢

在哺乳动物中，大多数磷脂合成起源于ER，这些脂质必须分布在整个细胞中才能组装新的细胞器（Chauhan等，2016）。ER中合成的五种最突出的磷脂（按丰度降序排列）是磷脂酰胆（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酸。PS可以作为PE和PC的前体，它们是主要的细胞磷脂。磷脂必须被运送到缺乏合成机制的膜上，以产生其完整脂质库。

PS在ER中由MAM酶PS合成酶1和PS合成酶2（PSS1和PSS2）合成。易位至线粒体后，PS被转运到哺乳动物细胞和酵母中的线粒体，并被磷脂酰丝氨酸脱羧酶（PSD）脱羧形成PE。最后，PE返回ER，磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2（PEMT2）将其甲基化以合成PC。PSS1和PSS2这两种酶都催化丝氨酸交换活性，而PSS1促进胆碱交换（Fernandez等，2016）。PE生成中的限速步骤是将PS通过MAM转移到线粒体中。此外，MAM含有胆固醇（CHOL）和神经酰胺（CER）生物合成所必需的酶，可以促进磷脂、CHOL和CER的运输（Issop等，2015）。在基础或静止状态下，位于MAM中的酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）催化游离胆固醇形成胆固醇酯，从而控制膜结合和细胞质脂滴储存的胆固醇之间的平衡（Vance等，2014）。在应激反应下，胆固醇向线粒体的输入是持续的，细胞色素P450随后启动类固醇的生成（Fujimoto等，2012）。在急性压力或激素刺激下，MAM相关的类固醇生成急性调节蛋白（StAR）通过与VDAC2蛋白的相互作用促进胆固醇进入线粒体，从而启动线粒体类固醇生成（Prasad等，2015）。此外，还有三磷酸腺苷酶家族蛋白3（ATAD3）在MA-10细胞的MAM中富集，其通过MAM来调节类固醇生成，从而在ER和线粒体之间引导胆固醇（Issop等，2015）。MAM脂筏微结构域中的高浓度胆固醇可以为线粒体中的类固醇生成提供游离胆固醇 （Hayashi等，2010）。此外，降低MAM中的胆固醇可显著促进MAM和线粒体之间的关联，并导致PS从头合成的同时改善PE合成（Fujimoto等，2012）。MAM中似乎产生了一定的神经酰胺库，因为它们在蛋白质组中含有鞘磷脂磷酸二酯酶（SMASE）、神经酰胺成酶（CerS）和二氢神经酰胺去饱和酶（DES）（Wu等，2010）。可见MAM的结构与功能完整性的维护需要脂质运输。

2 钙信号稳态

钙离子 （Ca2+）是一种多功能的细胞内信号分子，可调节哺乳动物的细胞和生理功能（Rodriguez等，2022）。在MAM中发现了多种形式的Ca2+通道和调节剂之间的相互作用，其调节Ca2+依赖的细胞功能以及维持Ca2+稳态。Ca2+通道的功能是通过从细胞外空间流入的Ca2+或从细胞内Ca2+储存中释放Ca2+来提高细胞质Ca2+浓度。Ca2+通过与含有Ca2+结合域的蛋白质结合来传递信息，并通过Ca2+传感器蛋白（如钙调蛋白）直接或间接调节其构象和活性。细胞器间通信通常采用Ca2+信号的形式，这些Ca2+信号源自ER，其能调节不同的细胞过程，如代谢、受精、迁移和细胞转运等（Carafol等，2016）。Ca2+信号的主要目标是线粒体，ER到线粒体Ca2+转移通过线粒体相关的MAM，即位于线粒体附近的ER结构。MAM中Ca2+的浓度比细胞溶胶中的高多倍，从而能使线粒体快速摄取Ca2+。ER到线粒体界面的不同蛋白质维持两个细胞器之间的Ca2+转移。肌醇三磷酸（IP3R）是位于ER膜上的依赖性钙通道，其能控制Ca2+从ER到胞质溶胶的流出，IP3R在细胞分化、存活和凋亡中发挥作用。当ER和线粒体被特定的锚定蛋白束缚时，ER膜上的IP3R可以在OMM处与VDAC1组装，这要归功于Grp75、TOM70和MCU蛋白质。这种复合物有利于ER通过IP3Rs释放的Ca2+直接隧穿到线粒体，从而刺激线粒体代谢。由于能量产生和细胞死亡可以由不同水平的Ca2+触发，因此MAM在线粒体中Ca2+水平的精细化中起着关键作用。生理条件下线粒体Ca2+的上调会激活线粒体酶，从而促进TCA循环和氧化磷酸化。可见ER到线粒体功能性的缺陷降低了线粒体Ca2+摄取的效率，从而抑制了线粒体代谢。

在线粒体中，Ca2+信号取决于其功能特性。虽然Ca2+振荡刺激新陈代谢并构成促生存信号，但线粒体Ca2+超载导致细胞凋亡。许多化疗药物依赖于有效的内质网线粒体Ca2+信号来发挥其功能。 Ca2+信号的特异性是通过控制Ca2+增加的幅度和时空特性来实现的。因此在空间上，Ca2+增加可能发生在Ca2+通道附近的受限微区或整个细胞质中，蛋白激酶磷酸酶和转录因子的Ca2+瞬变可以以不同频率重复并由下游效应分子来解码。这种复杂Ca2+信号模式的机制，其包括Ca2+结合蛋白限制游离Ca2+的扩散以及Ca2+本身和Ca2+传感器对Ca2+运输系统的正负反馈调节的蛋白质（Islam等，2020）。此外Ca2+对调节癌症的增殖、转移、血管生成、线粒体能量产生和对细胞死亡的敏感性起着一定的作用。因此MAM可以调动内质网钙信号的传导来调节线粒体的活性。

3 线粒体形态功能调控

线粒体是动态的细胞器，不断地进行融合和裂变并沿细胞骨架移动。根据细胞类型和对细胞生理学的反应，线粒体表现出多种结构，从分布在整个细胞中的高度连接的管状结构到聚集在某些细胞中的碎片、聚集结构。线粒体形态通过连续动态变化裂变和融合形成相互连接的线粒体网络，这种动态形态对于正常的线粒体和细胞功能至关重要（Benard等，2009），它们与细胞凋亡也有着密切联系。细胞凋亡刺激引发的线粒体裂变，伴随着嵴解体、线粒体外膜的透化和细胞凋亡调节蛋白的释放（Labbe等，2014），高分子质量的GTP酶是这些形态动力学的关键调节剂。线粒体的两个膜，即外膜和内膜，有两种不同的动力蛋白相关GTP酶介导膜融合。大量的调节蛋白存在于线粒体相关的MAM上，以保持细胞器之间的最佳距离并协调ER和线粒体的功能。哺乳动物外膜的融合由丝裂融合蛋白（Mfn1和Mfn2）和内膜蛋白Opa1和Mgm1介导，它们对于线粒体融合至关重要（Tilokani等，2018）。哺乳动物线粒体分裂是由发动蛋白相关GTP酶Drp1介导的，而酵母中线粒体分裂是由Dnm1蛋白介导（Lee等，2016）。在哺乳动物中，Mfn2和Opa1分别是神经退行性疾病Charcot-Marie牙齿病和常染色体显性遗传性视神经萎缩疾病的致病基因产物 （Pipis等，2020）。

ER与线粒体接触并在Drp1和Mff蛋白募集之前介导线粒体收缩，这表明ER在线粒体分裂中也有着重要的作用。之后发现ER结合肌动蛋白聚合蛋白INF2进行肌动蛋白丝聚合，导致线粒体收缩（Sheffer等，2016）。肌动蛋白与Drp1融合会刺激Drp1蛋白GTP酶的活性，导致线粒体裂变（Ji等，2015）。除了INF2外，在线粒体上的肌动蛋白的组装和分解都是瞬时发生的，这些过程是由肌动蛋白成核、结合蛋白和解聚蛋白介导（Moore等，2016）。除了驱动收缩外，肌动蛋白丝可以调节线粒体裂变所需的寡聚化蛋白Drp1（Hatch等，2016）。除了肌动蛋白之外，Syntaxin 17也是可以调节Drp1活性的蛋白质（Arasaki等，2015）。Syntaxin 17是一种最初与ER到高尔基体细胞内运输有关的SNARE（SNAP受体）蛋白，它定位于MAM和线粒体，与Drp1在MAM的定位和活性中起到作用。可见，为了维持线粒体裂变和融合之间的平衡，需要ER、MAM和线粒体之间的紧密结合。

4 MAM相关蛋白的调控功能

MAM许多生理作用归因于ER和线粒体元素之间的接触位点的形成，因此，识别在MAM和线粒体之间起作用的蛋白质已成为一个活跃的研究领域。这些接触部位的ER和线粒体之间的距离为10～30 nm（Csordas等，2006），因此连接ER、MAM和线粒体的蛋白质桥可以容纳在这个空间内。研究表明，钙连接蛋白和氧化还原酶TMX的棕榈酰化使MAM中起作用的蛋白质富集。此外，棕榈酰化位点的突变阻止了这些蛋白质在MAM中的积累，这表明蛋白质棕榈酰化可能提供一种将某些蛋白质靶向MAM的机制（Lynes等，2012）。从哺乳动物细胞和组织（Poston等，2013）以及酵母中分离出来的MAM中的蛋白质，进行蛋白质组学筛选鉴定出的大多数蛋白质，它们不太可能直接参与将MAM束缚到线粒体。大多数富含MAM的脂质生物合成酶，它们不直接连接相邻的膜，例如肌醇-1，4，5-三磷酸受体、σ因子-1、动力蛋白样蛋白DRP1、氧化还原酶Ero1和MAM中参与钙信号调节与转运的蛋白质VDAC。而Akt介导的多功能磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白PACS2，是用于稳定MAM结构与功能的蛋白（Betz等，2013）。

大鼠肝线粒体的轻度蛋白水解表明，线粒体外膜含有PS输入线粒体所需的蛋白质。这表明线粒体蛋白质参与了MAM和线粒体之间的关联（Vance等，2015），PS进入线粒体脱羧成PE不需要可溶性胞质蛋白。然而，在牛脑中一种细胞溶质的钙结合蛋白S100B，透化中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中PS向线粒体的输入显著增强，这表明S100B可能促进MAM和线粒体之间的相互作用（Seguella等，2020）。在其他研究中，产生了一种突变CHO细胞系R41（Shiino等，2021），其中PS的荧光类似物从线粒体外膜的外叶输入到线粒体内膜外侧的PSD位点被抑制。哺乳动物细胞中线粒体泛素连接酶MITOL调节ER到线粒体接触的形成（Sugiura等，2013），这表明哺乳动物细胞的泛素化也可能促进MAM到线粒体接触位点的形成。

5 MAM参与细胞凋亡

哺乳动物细胞线粒体动力学和形态（即融合和裂变）受MAM到线粒体接触点形成的调节（Hoppins等，2012）。在细胞凋亡过程中，由于分裂蛋白DRP1募集到线粒体外膜，线粒体碎片增加。相反，当线粒体融合增加时，细胞凋亡会减弱（Wasiak等，2007），在MAM的多功能分选蛋白PACS2耗尽后也诱导细胞凋亡。PACS2的消耗使ER与线粒体解离并诱导线粒体断裂（Simmen等，2005）。而Drp1与线粒体的结合在细胞凋亡过程中增加（Wang等，2015），并且线粒体断裂位点的Drp1与细胞凋亡期间线粒体上的促凋亡蛋白Bax共定位（Wu等，2011）。虽然线粒体断裂本身并不一定会导致细胞凋亡，但线粒体裂变融合机制的组成部分可以正负调节细胞凋亡。可见，线粒体裂变和融合的速度可能与细胞程序性死亡过程直接相关。因此，MAM与线粒体接触位点的破坏以及线粒体裂变的相应增加与细胞凋亡的诱导有关，细胞凋亡也与线粒体的钙状态密切相关。电子断层扫描研究表明，ER和线粒体的接触部位可以增加细胞凋亡（Csordas等，2006）。例如，当过量的钙通过高度集中在MAM中的1，4，5-三磷酸肌醇受体，它从ER流出进入线粒体时，就会发生细胞凋亡。相反，在部分耗尽肌醇-1，4，5-三磷酸受体的细胞中，细胞凋亡减弱 （Liang等，2017）。钙从ER流入线粒体，促进了促凋亡线粒体外膜蛋白Bax的寡聚化，并导致线粒体外膜的透化。因此，细胞色素C被释放到细胞质中，在此处激活半胱天冬酶级联反应，最终诱导细胞凋亡（Deng等，2021）。Ca2+介导的线粒体分裂蛋白DRP1的激活也刺激Bax寡聚化并增加细胞凋亡（Hoppins等，2012）。综上所述，MAM和线粒体之间接触位点的形成，在功能上与线粒体Ca2+以及细胞凋亡有关。

6 MAM参与自噬

MAM自噬是一种细胞内降解过程，是一种重要的机制，其需要不断降解功能失常或不需要细胞的结构，其中细胞质成分被称为自噬体的隔离双膜结构（Lamb等，2013）。自噬体与溶酶体融合成为自噬溶酶体，成分被溶酶体内的蛋白酶和水解酶降解。基础自噬发生在条件正常的情况下，但营养缺乏和其他压力会刺激自噬。自噬的执行是由自噬相关蛋白质Atg与参与膜运输的蛋白质共同介导。自噬始于隔离膜即细胞自我吞噬的一个过程，隔离膜在ER富含磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的亚区中形成。隔离膜的扩增可能是由于从起始开始合成脂质，这是由两种复合物ULK和PI3-激酶复合物的循环激活驱动的（Ktistakis等，2016），以及来自ER、高尔基体中间隔室、高尔基体、内体和质膜（Lamb等，2013）的膜供应。新生的隔离膜吞噬细胞质成分和随着膜的闭合，它们最终从内质网分离以形成自噬体。通过MAM导入的PS在线粒体中合成的PE荧光类似物被递送至自噬体。此外，自噬体的形成在细胞中受到严重损害，其中ER与线粒体接触已因线粒体融合蛋白的消耗而中断（Hamasaki等，2013）。因此，这些研究表明，自噬体的形成和自噬需要MAM与线粒体接触。PE代谢和自噬体之间是自噬体标记蛋白LC3与PE共价的连接（Magalhaes等，2021），增加了与LC3结合的PE在线粒体中由PS合成的可能性，即通过MAM输入线粒体。

自噬体形成发生在MAM和线粒体接触部位，自噬体标记蛋白ATG5和ATG14在饥饿诱导的自噬过程中仅定位于ER与线粒体接触位点，而在进食状态下，在MAM（Hong等，2019）中未检测到ATG14。此外，ER线粒体接触位点的破坏阻止了ATG14与MAM的关联，并排除了自噬体形成。这表明饥饿诱导的自噬体的产生发生在MAM与线粒体接触部位，并且可能需要线粒体衍生的PE的参与。可见MAM参与并调控细胞的自噬。

7 小结

细胞稳态的维持涉及多个细胞器的参与。作为ER与线粒体之间最直接的连接媒介，MAM直接位于这两个细胞器之间，并紧密参与从ER到线粒体的应激信号的转导；在某些情况下，它们会将凋亡信号传递回ER。这不仅保证了两个细胞器之间功能的互补性，而且放大了两个细胞器之间的凋亡信号，从而促进了协调的功能反应。MAM富含脂质代谢酶和钙处理蛋白。在细胞应激情况下，如细胞氧化还原状态的改变，MAM会改变其调节蛋白组，从而改变MAM的功能。此外，MAM和线粒体接触的缺陷可以导致心肌病、肥胖、癌症和神经退行性疾病等（Islam等，2020），有些疾病表现出线粒体形态和钙稳态的改变，增加的线粒体碎片可以通过氧化磷酸化减少ATP的产生，这都严重影响了线粒体的功能。这些表明MAM的功能改变可能是这些常见疾病发病机制的基础，这为后续的研究提供了理论依据。尽管近年来对MAM的研究取得了一些进展，但MAM的潜在机制仍有一些不确定性，仍需要解决。因此对MAM需要更加深入的研究，期许MAM更进一步的研究会使生殖医学及生物工程技术产生新突破。