短链脂肪酸在动物样本中的检测方法研究进展

刘娜 焦京琳 饶正华

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），又称挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA），是肠道内未消化的复合碳水化合物被结肠厌氧微生物发酵的主要代谢终产物［1］。其由碳链为1-6的有机羧酸构成，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等，SCFAs可降低畜禽胃肠道内容物的pH 值，抑制病原菌的生长，同时促进养分的吸收［2］。通常情况下，动物的SCFAs来源有两个方面，一是直接通过外源获取，二是通过后肠微生物的发酵产生，后者也是动物获取SCFAs的主要方式［3］。SCFAs作为营养物质通过瘤胃或肠道上皮细胞被吸收，为反刍动物提供大部分代谢能量需求［4］。在瘤胃液内的含量高达90-150 mmol/L，其中约80%的SCFAs在反刍动物瘤胃和网胃内被吸收，剩余的SCFAs主要在瓣胃和皱胃吸收［5］。对非反刍动物来说，SCFAs主要是膳食纤维通过微生物在结肠（猪）或盲肠（禽）发酵合成，是肠道上皮细胞的主要能量物质，为其提供60%-70%的能量需求，是维持动物肠道健康的重要物质［6］。SCFAs可维持动物肠道内环境稳态，促进肠道的消化吸收，激活肠道免疫应答，调节细胞分化与凋亡，调节机体的脂质代谢及糖代谢［7］。在动物健康和饲料营养研究中短链脂肪酸的浓度越来越受到关注，因此SCFAs的检测方法凸显尤为重要。

动物样本和人体样本不尽相同。目前更多的检测方法是应用在人体粪便中，而关注动物样本检测方法优化的研究略少。SCFAs 是一类半衰期短、代谢快的挥发性化合物。不同的生物样本中SCFAs的前处理方法不同，粪便中前处理常见有蒸馏法、高速离心法及超滤法等；常用检测方法包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等。本文综述了近几年来不同动物样本中SCFAs 检测主流的前处理和仪器分析方法，对比各方法的利弊，以期为SCFAs在动物样本中检测提供理论参考。

1 前处理

1.1 不同动物样本前处理方法

1.1.1 动物粪便样本 由于肠道中SCFAs的组成与宿主肠道菌群直接关联，所以动物肠道菌群的研究中常常检测动物的粪便样本［8-9］。SCFAs 具有自身极性大、挥发性强、水溶性大的特点使样本快速处理尤为重要，常规的蒸馏、衍生化、萃取等方法耗时、耗有机试剂、污染大，因此在分离效果好的基础上需要简单、准确且快速直接的前处理方法［10］。动物粪便样本的前处理方式较人体样本相对简单。在养殖场采集新鲜粪便后用低温转运箱运送到实验室进行检测，同时可备份样品在-80℃下冷冻保存。一般动物粪便样本前处理包括提取和低温高速离心，随后取上清液过膜进样。提取时可以采用蒸馏水或盐酸溶液，其中盐酸可以用5%浓度［11］或0.1%浓度［12］等；蒸馏水可以与样本量等体积［13-15］，可以8倍体积［16-17］等，然后超声20 min。蒋恺憧等［1］比较了酸（盐酸溶液，pH 2）提取法和水（灭菌去离子水）提取法对于犊牛和小鼠的新鲜粪便中SCFAs的测定，结果表明2种方法均可检测到6 种SCFAs，且水提法的SCFAs 检测浓度高于酸提法，但无显著性差异。样本提取后一般采用4℃高速（离心力10 000 ×g以上）离心至少10 min后取上清液待测。

1.1.2 动物肠道样本 乙酸、丙酸和丁酸在猪的结肠短链脂肪酸中占据85%甚至更高的比例［18-19］。动物肠道内SCFAs的浓度主要取决于动物肠道内微生物群组成、饲粮中纤维的含量、饲料在肠道内的消化时间以及宿主与微生物的代谢通量。研究表明饲粮纤维水平可通过调节肠道微生物从而显著影响宿主的肠道健康，而这一过程可能源于纤维在后肠发酵产生SCFAs模式和浓度的差异［20］。不同纤维来源非淀粉多糖也会改变动物肠道中短链脂肪酸的种类和数量。Pieper等［21］在仔猪日粮中添加了麦麸和甜菜碱，发现猪结肠中乙酸的比例从58%增至62.7%，丙酸比例从25.7%降至23%。因此，研究学者常常通过动物肠道中短链脂肪酸的浓度变化来开展饲料营养与动物健康方面的研究。

动物肠道样本在前处理过程中常用水提取。研究学者发现猪回肠食糜可以采用等体积双蒸水提取［22］，肉鸡盲肠食糜可以用两倍体积生理盐水提取［23］，肉兔盲肠内容物采用蒸馏水稀释10倍提取［24］，白鹅盲肠（半固体状）采用两倍体积蒸馏水稀释提取［25］。提取后进行低温高速离心，再加入25%偏磷酸（也可以是25%偏磷酸-巴豆酸）溶液混匀，随后可以-20℃冰箱中过夜，也可以在冰水浴中放置半小时以上，最后低温高速离心去除蛋白质沉淀物，取上清液过膜进样。

1.1.3 动物瘤胃样本 反刍动物为复胃动物，其中瘤胃是最大的胃，掌握反刍动物瘤胃中短链脂肪酸浓度对监测动物身体状况、调整营养水平、提高动物机体免疫力等具有重要意义［26］。瘤胃液的采集一般是用胃管式瘤胃采样器，采集后装于冻存管中并迅速置入液氮罐中冷冻，再带回实验室-80℃保存。研究学者在处理牛和羊的瘤胃液样本时前处理操作相对简单。离心可以清除瘤胃液中的颗粒物，牛瘤胃液可以先低速（6 000×g）离心10 min后再取上清液继续高速（14 000×g）离心10 min［27］，也可以直接高速（20 000×g）离心25 min取上清液［28］或16 100×g下离心30 min取上清液［29］。羊的瘤胃液同样可以先低速（转速5 400 r/min）离心10 min取上清液［30］。离心后的上清液均需要加25%偏磷酸混匀后再次低温高速离心后取上清液待测［31-33］。目前瘤胃液中短链脂肪酸也有团体标准《T/NAIA 005-2020》可以参考，同样用25%偏磷酸除去可溶性蛋白质后10 000 r/min离心10 min后上清液过膜直接进样。

1.2 内标物的选择

在短链脂肪酸含量测定时常使用内标化合物。用内标法测定时需在样品中加入一种物质作内标，而内标物应符合以下条件：（1）应是样品中不存在的纯物质；（2）内标物质的色谱峰位置，应位于被测组分色谱峰附近或在几个被测组分色谱峰中间，且与这些组分能完全分离；（3）其物理性质及理化性质应与被测组分相近；（4）加入的量应与被测组分含量接近［34-35］。因此根据内标物的选择原则并结合实验室已有物质，短链脂肪酸测定时可选用异己酸［27］、4-甲基戊酸［28］、巴豆酸及丙二酸［30］、2-乙基丁酸（2EB）［31-33］、2-甲基丁酸［36］等为内标物质。

1.3 同位素示踪法

动物大肠中发酵产生的部分短链脂肪酸在肠道被吸收，供机体利用，而未被吸收利用的则随着大肠内容物以粪便的形式排出体外［37］，因此有学者关注短链脂肪酸在动物体内的去向研究，常利用同位素示踪法测定短链脂肪酸。同位素示踪剂对动物灌注常采用13C标记。Markantonatos等［38］将13C-乙酸钠盐、13C-丙酸钠盐和13C-丁酸钠盐注入荷斯坦母牛瘤胃中进行短链脂肪酸测定，瘤胃液前处理时同样加入偏磷酸后低温高速离心。张博等［37］利用［13C］-VFA（乙酸、丙酸、丁酸）稳定性同位素灌注法，跟踪猪大肠内产生的VFA 的去向，前处理时将大肠肠道组织用液氮研磨，随后用超纯水溶解并稀释，超声提取，随后高速离心取上清液待测。

1.4 衍生化法

衍生化是将一些难于分析检测的物质转化为稳定且易于分析的物质。羧基的极性比较强，在气相色谱柱中易产生吸附从而使结果的重现性差，尤其在浓度低（<1 mmol/L）时发生［39］。而在液相系统中短链脂肪酸又缺乏合适的发色基团。因此短链脂肪酸检测中常需要进行柱前衍生化，主要是通过增加结构中的发色基团提高紫外检测器等的响应，或者是通过降低其挥发性避免分析过程中短链脂肪酸的逸失，使测定结果更加精准［40］。羟基、羧基、胺、硫醇、磷酸盐等官能团在气相色谱分析高温环境下可能不稳定，因此需要通过某些硅基化试剂进行衍生化［41］。衍生化可以提高化合物稳定性、灵敏度及分离度。常用的衍生试剂有吡啶［42］、氯甲酸丙酯［43］、硝基苯肼等［44］。对样品进行简单的酸化也是短链脂肪酸测定中常用的方法，主要包括盐酸、偏磷酸、甲酸、高氯酸等［45-48］，可以减少峰拖尾现象，也有利于脱蛋白，起到除杂质和提高分离度的作用。同时短链脂肪酸为酸性化合物，在溶液中有离子型和游离型两种状态，加入偏磷酸可使短链脂肪酸处于游离态，有利于测定［49］。

2 仪器分析方法

2.1 气相色谱

1952年首次报道了利用气相色谱检测短链脂肪酸［50］。目前利用气相色谱分析短链脂肪酸也是最常见的技术手段之一，仪器可靠性高，操作简单。在色谱柱的选择上，通常采用毛细管柱，利用相似相溶原则选择合适固定相的色谱柱。常用的色谱柱有DB-FFAP［10，36］、Inter Cap Wax［1］、SH-Stabilwax［51］等。检测器通常选用火焰离子化检测器（FID）。FID是用氢气在空气中燃烧所产生的火焰使被测物质离子化。气相色谱检测短链脂肪酸时需要设置升温程序，一般采用分流进样。

对于反刍动物瘤胃液成分杂质较多，对仪器的进样口和色谱柱会造成一定程度污染，降低分析的准确性，也缩短了色谱柱的使用寿命［52］。一些学者也利用顶空进样法对复杂基质中短链脂肪酸进行测定［53-54］。王俊红等［51］分析奶牛和湖羊的瘤胃液中短链脂肪酸时，利用顶空-气相色谱法检测，无需样品前处理过程，称取一定量样品放入顶空瓶中，在85℃平衡预热30 min后取平衡气体直接进行测定。顶空进样需要在气相色谱上配备顶空进样装置，节约了样本前处理的时间，有效降低了样品中杂质对色谱柱的污染［55］。气相色谱操作简单，前处理方法也无需衍生化，但仪器程序升温需要单独消耗时间，仪器运行时间大约20 min，且灵敏度上不如质谱联用仪器高，适合动物样本中短链脂肪酸浓度高的样品检测。

2.2 气相色谱串联质谱

气相色谱串联质谱法是在气相色谱基础上，样品中各组分经气相色谱分离后，质谱作为其检测器，先将被测物质离子化，根据离子的质荷比进行分离，测定各种离子谱峰的强度而实现分析目的［56］。质谱法较单纯色谱法相比不光能定量，还能更准确地对短链脂肪酸进行定性，并有效减少干扰峰，且灵敏度也大大提升，同时气质仪器还有用相应的质谱谱库。Douny等［57］利用GC-MS全扫模式，质量范围在40-150 Da下检测猪体外模拟胃肠道模型中短链脂肪酸。Bianchi等［58］同样用GC-MS全扫模式，质量范围在35-150 amu下检测短链脂肪酸含量。气相色谱串联质谱仪较气相色谱在灵敏度上有所提升，而且有谱库可以比对，没有标准品情况下也能对样品中短链脂肪酸进行定性，但前处理步骤也相对复杂，分析时间上同气相一样仪器基本也运行20 min。

2.3 液相色谱

液相色谱原理是流动相与检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物中不同物质与固定相的相互作用力不同，不同的物质先后被洗脱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。利用液相色谱检测短链脂肪酸，常用紫外检测器。但由于SCFAs的极性和挥发性，以及缺乏合适的发色团，使得SCFAs的提取和在紫外检测中有信号变得更加困难。一般需要用酸性流动相且用硝基苯肼等衍生化。流动相组成中水相可以用20 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.2）［59］、高氯酸溶液（pH 2.1）［60］、磷酸溶液（pH 2.5）［61］等，有机相一般用乙腈溶液。检测波长可以选210 nm［59-60］或400 nm［61］。液相色谱检测虽提升了灵敏度，但需要衍生化，增加了实验步骤，且强酸流动需要注意维护色谱柱。

2.4 液相色谱串联质谱

为了提高短链脂肪酸的灵敏度，科学家也开发了利用液相色谱串联质谱的检测方法。短链脂肪酸类化合物在质谱中响应很低，且高亲水性及极性特点导致其在反相色谱柱上保留很弱，因此常采用衍生化法进行测定。离子源通常采用大气压电喷雾离子源（ESI源），扫描模式是ESI+［62］。流动相中水相可以采用0.1%甲酸水［63］，10 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸）［64］等；有机相选择乙腈［65］，0.1%甲酸甲醇等溶液进行梯度洗脱。研究表明衍生剂添加的官能团可以通过在电喷雾离子源中更有效地电离，或在碰撞池中更容易地碰撞诱导解离，产生独特和高度丰富的特征片段离子来潜在地提高灵敏度［64］。衍生化试剂可以选择4-AMBA［63］，0.1 mol/L甲醇中丁基羟基茴香醚（BHA）溶液和甲醇中0.25 mol/L 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）［64］，d0/d6-邻苯二甲酸二庚酯（d0/d6-DHPP）试剂等［65］。液相色谱串联质谱缩短了检测时间，大大提高了灵敏度，同时能检测多种脂肪酸，但同样需要衍生化，需要购买合适的衍生化试剂以完成检测。

2.5 离子色谱

离子色谱是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱，它是利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。离子色谱的分离原理主要是离子交换，基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换，不同离子因与交换剂的亲和力不同而被分离，与液相色谱不用的是，离子色谱选择性的改变主要是通过不同的固定相来实现的［56］。离子色谱可以识别以下阴离子：甲酸、醋酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、庚酸酯和辛酸酯［66］。样品需要被氧化，产生的有机阴离子进行收集。可以采用不同浓度的硫酸溶液和硫酸/丙酮溶液作为洗脱液［67］。Wu等［16］和Liu等［17］测定断奶小猪消化物时均利用离子色谱检测。离子色谱检测时前处理过程中需要添加试剂以实现氧化，因此增加了前处理步骤。

3 总结与展望

短链脂肪酸是维持动物肠道平衡的重要代谢产物，在动物体内能参与不同器官的代谢，因此其检测方法尤为重要。动物样本涉及的基质类型相对人体样本多，其检测前处理技术上普遍采用低温高速离心后直接上样。仪器方面主要应用色谱及色谱质谱联用技术，各项检测技术各有利弊，根据样品浓度高低的要求，以及实验室自身仪器装备来选择不同的检测技术。由于短链脂肪酸类化合物具有极性大、挥发性强及水溶性大的特点增加了其检测难度，因此为了提高检测的灵敏度常采用衍生化的方法，根据使用仪器的不同需要采用不同的衍生化试剂。

未来短链脂肪酸在动物样本中检测方法的开发中，应结合现在高分辨质谱的优势，在不衍生化，尽量少前处理步骤的条件下进行研发。目前高分辨质谱技术崛起，具有高分辨率、高灵敏度和高准确度的仪器为未来检测带来无限可能。