血清循环游离DNA联合HE4、CA15-3、CYFRA21-1对卵巢癌诊断和分期评估的价值▲

朱玉凤 欧阳海红 罗浩明 王小凤 陈建设

(1 湖南省邵阳市中心医院检验科，湖南省邵阳市 422000； 2 湘南学院公共卫生学院，湖南省郴州市 423000)

卵巢癌是女性生殖系统的恶性肿瘤之一，是致死率最高的妇科肿瘤，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌[1]。由于卵巢肿瘤早期症状不明显，仅有少数卵巢癌患者在Ⅰ期获得诊断，多数患者确诊时已进展至中晚期，其恶性程度高、易发生转移，患者5年生存率低[2]。因此，早期诊断对于及时治疗和改善卵巢癌患者的预后具有重要意义[3]。循环游离 DNA(circulating free DNA，cf-DNA)是指循环血中游离于细胞外的高度片段化DNA，cf-DNA在甲状腺癌、食管癌等多种肿瘤中的表达水平升高，对肿瘤具有一定的诊断价值[4-5]。人附睾蛋白4(human epididymal protein 4，HE4)是一种肿瘤标志物，其在卵巢癌组织中呈高水平表达，在鉴别诊断良恶性卵巢肿瘤和不同分期卵巢癌中具有一定价值[6]。糖蛋白抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)是一种常用的肿瘤标志物，可用于诊断早期卵巢癌[7]。细胞角质蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)存在于肿瘤细胞的上皮胞质中，当组织发生癌变时，角蛋白被降解，血液中CYFRA21-1水平升高[8]。有研究表明，卵巢癌患者血清CYFRA21-1水平明显升高，且与病情严重程度有关[9]。本研究以病理诊断结果为金标准，探讨血清cf-DNA联合HE4、CA15-3、CYFRA21-1在卵巢癌诊断和分期评估中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年7月至2020年10月在湖南省邵阳市中心医院就诊的91例卵巢癌患者为卵巢癌组，年龄20～73(47.20±7.50)岁，其中国际妇产科协会分期Ⅰ～Ⅱ期37例(早期组)、Ⅲ～Ⅳ期54例(中晚期组)。纳入标准：(1)所有患者均接受手术治疗，术后经病理检查确诊为卵巢癌；(2)初次发病；(3)术前未接受放化疗；(4)患者对本研究知情同意并配合完成相关检查。排除标准：(1)合并免疫性疾病、严重精神病等其他严重疾病者；(2)伴有其他类型肿瘤或者卵巢癌复发患者；(3)临床资料不全者。另选取同期88例卵巢良性肿瘤患者作为卵巢良性肿瘤组，其中成熟性畸胎瘤25例、黏液性囊腺瘤35例、卵巢子宫内膜异位囊肿28例，年龄 22～72(47.50±7.30)岁。纳入标准：(1)经病理诊断为卵巢肿瘤良性病变；(2)无其他恶性肿瘤病史。排除标准：合并精神疾病或不能配合完成相关检查。选取同期健康体检女性90例为对照组，年龄23～72(47.30±7.20)岁。纳入标准：(1)无任何恶性肿瘤疾病史或家族史；(2)无免疫性疾病或其他疾病者。排除标准：(1)感染性疾病、精神疾病等其他疾病患者；(2)卵巢疾病患者。3组研究对象的年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经过湖南省邵阳市中心医院医学伦理委员会批准(批准文号：20180019)，所有研究对象均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的检测方法

1.2.1 主要试剂与仪器： cf-DNA快速提取试剂盒(Epigenetics公司，批号：QE0905T)，人类基因组DNA标准品(Promega公司，批号：D1521)，HE4 ELISA试剂盒(R&D systems公司， 批号：DHE400)，CYFRA21-1 ELISA试剂盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd，批号：E-EL-H2077c),CA15-3检测试剂盒(上海罗氏制药有限公司，批号：329583)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E601型电化学发光仪购自上海罗氏制药有限公司。

1.2.2 样品采集及保存：采集所有观察对象清晨空腹静脉血4 mL，在室温条件下静置30 min后，以3 000 r/min离心15 min收集血清，分装后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测血清cf-DNA水平：使用cf-DNA快速提取试剂盒提取血清总cf-DNA，-20 ℃保存备用。以人端粒酶逆转录酶短片段基因为靶序列， 采用Primer Premier 5.0软件设计引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列为5′-AGCCGTGTTCTTTGCACTTT-3′，下游引物序列为5′-CAGAGGCGTACAGGGATAGC-3′。采用实时荧光定量PCR检测血清cf-DNA水平。PCR反应体系共25 μL，包括SYBR® Premix Ex Taq 10 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、上下游引物各0.2 μL、模板cf-DNA 1 μL、血清cf-DNA 2 μL，加双蒸水至25 μL。扩增条件为预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s，退火95 ℃ 5 s，延伸60 ℃ 30 s，共40个循环。以人类基因组DNA为标准品，按10倍梯度进行连续稀释，根据标准品的浓度梯度由PCR仪自动分析绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算cf-DNA水平。

1.2.4 检测血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平：采用ELISA检测血清HE4、CYFRA21-1水平，采用化学发光法检测CA15-3水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布的计量资料以 [M(P25，P75)]表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多个独立样本的比较采用 Kruskal-WallisH检验；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清cf-DNA联合HE4、CA153、CYFRA21-1诊断卵巢癌和评估分期的价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比较 对照组、卵巢良性肿瘤组、卵巢癌组的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平依次升高(均P<0.05)。见表1。

表1 3组血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比较[M(P25，P75)]

2.2 不同分期卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比较 与早期组比较，中晚期组患者的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高(均P<0.05)，见表2。

表2 不同分期卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比较[M(P25，P75)]

2.3 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平单独或联合诊断卵巢癌的价值 采用约登指数最大法确定单一指标的诊断临界值，采用Logistic模型的预测概率得到4个指标联合诊断的标准。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平联合诊断卵巢癌的敏感度、特异度、曲线下面积(area under the curve,AUC)高于或大于单一指标诊断(均P<0.05)，见表3、表4和图1 。

表3 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平单独或联合诊断卵巢癌的价值

表4 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平联合诊断与单独诊断卵巢癌效能的比较

图1 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平单独诊断及联合诊断卵巢癌的ROC曲线

2.4 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平单独或联合评估卵巢癌分期的价值 采用约登指数最大法确定单一指标的诊断临界值，采用Logistic模型的预测概率得到4个指标联合诊断的标准。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1联合诊断早期卵巢癌的AUC为0.970，敏感度为89.19%，特异度为98.15%，AUC与特异度均大于或高于单一指标诊断，见表5、表6、图2。

表5 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平单独诊断或联合诊断早期卵巢癌的效能

表6 血清cf-DNA、HE4、CA153、CYFRA21-1水平联合诊断与单独诊断早期卵巢癌效能的比较

图2 血清 cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平单独诊断或联合诊断早期卵巢癌的ROC曲线

3 讨 论

卵巢肿瘤是女性常见的生殖系统肿瘤，卵巢癌早期症状不明显或缺乏特异症状，多数患者确诊时已处于中晚期。由于卵巢癌侵袭力强、复发率高、缺乏有效治疗方法，患者的预后较差，其是导致妇科癌症患者死亡的主要原因，因此有效鉴别卵巢肿瘤的良恶性并尽早治疗，对提高患者生存期具有重要意义[10-12]。

cf-DNA是一种游离DNA，主要来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞，健康人血液中的cf-DNA水平较低，在肿瘤患者血液中cf-DNA 水平增高，因此cf-DNA 在肿瘤的诊断中具有重要意义[13-14]。有研究表明，与良性卵巢肿瘤组和健康卵巢组相比，卵巢癌组的cf-DNA水平显著升高，与Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌患者相比，Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者的cf-DNA水平显著升高[15]。胡秋博等[16]的研究表明，卵巢癌患者血浆cf-DNA水平高于健康女性，且与肿瘤体积的对数值呈正相关，将其用于区分卵巢癌患者与健康女性有一定价值。本研究结果显示，与健康女性比较，卵巢良性肿瘤患者和卵巢癌患者血清cf-DNA水平均升高，而卵巢癌患者血清cf-DNA水平高于卵巢良性肿瘤患者，且中晚期卵巢癌患者血清cf-DNA水平高于早期卵巢癌患者(均P<0.05)，与既往研究结果[16]相似，这提示血清cf-DNA水平有助于卵巢癌的诊断及其分期的评估。

HE4属于乳清酸性蛋白家族成员，其在卵巢癌患者血清中的表达水平较高，是卵巢癌临床诊断和预后评估的理想肿瘤标志物，但是其诊断早期卵巢癌的敏感性与特异性不高[17]。CA15-3为临床最常见的肿瘤标志物，在女性恶性肿瘤中的表达显著升高，如卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌等，其表达组织特异性较高，被认为是乳腺癌特异性最高的标志物，在乳腺肿瘤的鉴别诊断中应用广泛[18]。CYFRA21-1是一种新发现的上皮来源性质的肿瘤标志物，在乳腺癌中表达水平较高，且与乳腺癌的临床分期有关，CYFRA21-1在胃癌与肺癌患者血清中的表达水平也较高，其对恶性肿瘤的诊断具有一定价值[19-20]。本研究结果显示，与对照组比较，卵巢良性肿瘤组和卵巢癌组的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高；与卵巢良性肿瘤组比较，卵巢癌组的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高，且中晚期卵巢癌患者的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均高于早期卵巢癌患者(均P<0.05)，表明血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平升高对卵巢癌的诊断及分期评估可能均有一定指示作用。

绘制ROC曲线进一步评价4个指标的诊断效能，结果提示血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平在诊断卵巢癌和评估卵巢癌分期中均具有一定的效能，但单独诊断效能不高，且敏感度、特异度不高；而血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1联合诊断卵巢癌和评估卵巢癌分期的AUC均>0.95，诊断效果好，且四者联合诊断卵巢癌的AUC、敏感度与特异度大于或高于单一指标诊断，四者联合诊断早期卵巢癌的AUC、特异度大于或高于单一指标诊断(均P<0.05)。这提示血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1联合检测在卵巢癌的诊断和分期评估中均具有较高的价值。

综上所述，卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平升高，在中晚期患者中四者明显升高，血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平联合检测对卵巢癌的诊断和分期评估均有较高的效能，具有一定的临床应用意义。