荚膜甲基球菌蛋白替代鱼粉对卵形鲳鲹生长和抗氧化能力的影响

高文浩 彭树锋 廖春燕 董晓慧 谭北平 王 嘉 迟淑艳

(1.广东海洋大学水产经济动物营养与饲料实验室, 湛江 524088; 2.中国渔业协会金鲳鱼分会, 湛江 524000;3.恺勒司(上海)商务信息咨询有限公司, 上海 200060)

随着水产养殖业的快速发展和人民群众对优质水产品的需求增加, 水产养殖品种对所依赖的鱼粉等优质饲料原料的需求增加。然而, 据FAO统计数据显示, 近20年来, 由于过度捕捞, 全球鱼粉总产量呈逐年波动下降趋势[1], 2000年产量7.0×109kg,2012—2020年维持在4.7×109kg[2]。秘鲁和日本等国家生产的优质鱼粉价格高的同时难以满足饲料工业和水产养殖业快速发展的需求[3]。因此, 寻求部分或完全替代鱼粉的蛋白源是水产动物营养与饲料研究现阶段关注的主要目标[4]。

饲料蛋白源按原料来源可分为动物蛋白源、植物蛋白源和单细胞蛋白源, 其中单细胞蛋白源又可分为细菌蛋白和真菌蛋白。细菌可利用天然气、工业废气及生活污水等发酵, 生产菌体蛋白。生产原料来源广泛且价格低廉, 生产效率高成本低,代表性产品如乙醇梭菌蛋白、甲烷氧化菌蛋白和一些光合细菌蛋白等[3,5]。适宜比例的菌体蛋白饲料代替鱼粉饲喂肥育猪, 有利于提高试验猪的增重率和饲料利用率及维持猪皮毛光洁度, 并降低了养猪成本[5]。但是, 利用天然气发酵生产的菌体蛋白替代20%鱼粉, 对大西洋鲑生长性能无负面影响,但会降低消化率[6,7]。

荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus, Bath)是一种甲烷氧化菌, 可利用天然气中的甲烷与少量异养细菌混合发酵生产荚膜甲基球菌蛋白(MBM),粗蛋白含量可达70%, 氨基酸平衡[6], 粗脂肪含量约为8%, 其中主要脂肪酸为棕榈酸(占总脂肪酸的43.44%)和棕榈油酸(占总脂肪酸的23.00%)[8]。在大西洋鲑(Salmo salar)饲料中添加MBM可以预防或治疗由高含量的豆粕引起的肠炎[8,9], 改善其肠道菌群结构, 提高抗病力[9]; 替代10%的鱼粉可以激活大口黑鲈(Micropterus salmoides)TLR2诱导炎症细胞因子的产生来增强免疫反应, 有利于肠道健康[10];MBM替代鱼粉量达30%, 不会影响五条鰤(Seriola quinqueradiata)的生长性能[11], 替代45%的鱼粉可以提高凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)肝胰腺的抗氧化能力。

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus), 是硬骨鱼纲、鲈形目、鲹科、鲳鲹属鱼类, 俗称黄腊鲳、金鲳鱼,其肉质鲜美细嫩, 营养丰富, 是我国南方沿海人工养殖的经济鱼类之一[12]。本实验以卵形鲳鲹为实验对象, 用MBM替代饲料中一定比例的鱼粉, 研究其在卵形鲳鲹饲料中的适宜添加量, 为卵形鲳鲹饲料的研发及MBM在水产饲料中的应用提供数据支撑。

1 材料及方法

1.1 实验设计及配方

在基础饲料(鱼粉含量35%, MBM0)中分别添加3.5%、7%和10.5%的MBM, 替代10%、20%和30%的鱼粉, 记为MBM10、MBM20和MBM30组。[斐康®蛋白,恺勒司(上海)商务信息咨询有限公司]。根据配方(表1), 饲料原料粉碎后过60目筛, 按配方称量好各种原料, 逐级混合均匀后用双螺杆挤条机(华南理工大学科技实业总厂, F75型)制得粒径为2.0和2.5 mm的条状沉性饲料。自然风干后用封口袋分装编号, 置于–20℃冰箱保存备用。

表1 饲料配方及组成(%干物质)Tab.1 Formulation and proximate of experimental diets (% dry matter)

1.2 饲养管理

实验共4个处理, 每个处理3个重复, 每个重复40尾鱼, 于近海(广东省湛江市坡头区南三岛五里村, 21°15′6″N, 110°27′31″E)浮筏式网箱中(1 m×1 m×2 m)进行56d的养殖实验。日投喂两次(06:00和18:00), 根据摄食情况调整投喂至表观饱食, 并做好记录。养殖期间, 海水温度30—32℃, 盐度24‰—26‰,溶解氧≥6 mg/L。

1.3 样品采集

养殖实验结束, 禁饲24h后, 对每个网口计数、称重。每个重复随机抽取3尾测量体重、体长、肝脏重量和内脏团重量用于计算生长性能指标。随机抽取3尾鱼用于体常规分析; 随机抽取6尾鱼用于尾静脉采血, 取肝脏、肠道和肌肉分别用于测定抗氧化酶活性和消化酶活性。血液于4℃冰箱中保存静置24h后4000 r/min离心10min, 取上层血清, 用于测定血清生化指标。放于–80℃冰箱中保存备用。

1.4 饲料、全鱼及背肌常规养分含量测定

水分测定采用烘箱105℃干燥法测定(GZX-9146MBE干燥箱, 上海); 粗蛋白质测定采用杜马斯燃烧法测定(PrimacsSN-100杜马斯定氮仪, 荷兰);粗脂肪测定采用索式抽提法测定(ANKOM-XT15i自动脂肪分析仪, 美国); 粗灰分采用高温灼烧法测定(SX2-4-10N马弗炉, 上海)。

1.5 生理生化指标测定

血清甘油三酯、总胆固醇、白蛋白、总蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、丙二醛; 肝脏甘油三酯和总胆固醇及抗氧化指标; 肠道抗氧化指标、消化酶均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定, 用酶标仪(Thermofisher Multiskan GO, 美国)读取吸光度, 具体操作方法参照试剂盒使用说明书。肠道胰蛋白酶和肝脏过氧化氢酶用紫外可见光分光光度计(Thermofisher Evolution 220, 美国)读取吸光度。

1.6 肝脏切片

取肝脏样品固定在40%甲醛溶液中, 用于制作苏木精-伊红染色切片(武汉塞维尔生物科技有限公司), 每个处理组选取3张(每个重复1张)组织切片,使用显微镜(Eclipse Ci-L)测量200倍视野内空泡像素面积并用Image-Pro Plus 6.0分析软件进行数据分析。

1.7 计算公式

存活率(Survival rate, SR, %)=实验末鱼尾数/初始鱼尾数×100;

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100 ×(终末均重–初始均重)/初始均重;

饲料系数(Feed conversion ratio, FCR)=摄食饲料质量/(末重–初重);

特定生长率(Specific growth rate, SGR, %/d)=100×(ln末重–ln初重)/实验天数;

摄食率(Ingestion rate, IR, %/d)=投喂量/[饲养天数×(终末体重+初始体重)/2];

肝体比(Hepatosmatic index, HSI)=100×肝重/鱼体重;

脏体比(Visceral index, VSI)=100×内脏重/鱼体重;

肥满度(Condition factor, CF, g/cm3)=100×鱼体重/体长3;

空泡面积百分比(Percentage of void area, PVA%)=空泡像素面积/组织像素面积×100;

1.8 数据分析

使用SPSS 26.0软件对实验数据进行单因素方差分析, 得到的数据结果用(平均值±标准差)的形式来表示, 当各个实验组间有显著性差异时(P<0.05),再进行Duncan检验。使用Prism8对相关数据进行皮尔森(Pearson correlation 2-tailed)相关性分析, 显著水平为P<0.05。

2 结果

2.1 生长性能

如表2所示, 经过56d的养殖实验, MBM替代鱼粉的水平在10%—30%的各处理组, 实验鱼末均重、存活率、肝体比、脏体比、饲料系数与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。增重率和特定生长率逐渐降低, 但各组间无显著性差异(P>0.05); 肥满度随替代比例的增大而提高, MBM30组显著高于MBM0组(P<0.05)。

表2 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹生长性能的影响Tab.2 Effects of MBM on growth performance of Trachinotus ovatus (n=3)

2.2 全鱼及背肌营养成分

如表3所示, 随着MBM替代鱼粉的量增加, 各组全鱼粗蛋白、水分和背肌水分含量均无显著性差异(P>0.05)。MBM20组全鱼粗脂肪和背肌粗脂肪含量显著高于MBM0组(P<0.05), 与MBM0组相比, MBM30组背肌粗蛋白未见显著性差异(P>0.05),但粗脂肪含量显著升高(P<0.05)。如表4所示, 全鱼粗脂肪与MBM替代比例无显著相关关系(P>0.05),背肌粗脂肪与MBM替代比例呈显著正相关关系(P<0.05)。

表3 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹体组分的影响Tab.3 Effects of MBM replaces fishmeal on body composition of Trachinotus ovatus (n=3)

表4 MBM替代比例与卵形鲳鲹体粗脂肪组成的相关性分析Tab.4 Correlation between MBM replaces fishmeal ratio and crude fat composition of Trachinotus ovatus (n=3)

2.3 血清生理生化指标

如表5所示, MBM20和MBM30组血清甘油三酯显著低于MBM0组(P<0.05)。MBM20组总胆固醇含量与MBM0组相比差异不显著(P>0.05), MBM10和MBM30组则显著高于MBM0组(P<0.05)。MBM20组血清谷草转氨酶显著高于其余各组(P<0.05)。MBM0组白蛋白显著低于MBM10组(P<0.05), 与其余各组无显著性差异(P>0.05)。各组间血清谷丙转氨酶和总蛋白含量无显著性差异(P>0.05)。如表6所示, 血清甘油三酯与MBM替代鱼粉的比例呈显著负相关关系(P<0.05), 血清总胆固醇与MBM替代比例无显著相关关系(P>0.05)。

表5 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹血清生化指标的影响Tab.5 Effects of MBM replaces fishmeal on serum biochemical indices of Trachinotus ovatus (n=3)

表6 MBM替代鱼比例卵形鲳鲹血清脂质成分的相关性分析Tab.6 Correlation between MBM replaces fishmeal and serum lipid composition of Trachinotus ovatus (n=3)

2.4 肠道消化酶活性

如图1所示, 各实验组肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性无显著差异(P>0.05)。

图1 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹肠道消化酶活性的影响Fig.1 Effects of MBM on intestinal digestive enzyme activities of Trachinotus ovatus

2.5 组织抗氧化指标变化

如图2所示, MBM20组血清总抗氧化能力与MBM0无显著性差异(P>0.05), 显著高于MBM10和MBM30组(P<0.05), 各组间超氧化物歧化酶和丙二醛无显著性差异 (P>0.05)。

图2 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹血清抗氧化指标的影响Fig.2 Effects of MBM on serum antioxidant indices of Trachinotus ovatus

如图3所示, MBM20组肠道超氧化物歧化酶活性显著高于其余各组(P<0.05), MBM10组丙二醛含量显著低于其余各组(P<0.05)。

图3 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹肠道抗氧化指标的影响Fig.3 Effects of MBM on intestinal antioxidant indices of Trachinotus ovatus

如图4所示, MBM20和MBM30组肝脏过氧化氢酶活性与MBM0组无显著性差异(P>0.05), MBM30组显著高于MBM10组(P<0.05)。各组间总抗氧化能力和丙二醛含量无显著性差异(P>0.05)。

图4 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹肠道肝脏抗氧化指标的影响Fig.4 Effect of MBM instead of fishmeal on antioxidant indexes of intestine and liver of Trachinotus ovatus

2.6 肝脏脂质含量及组织形态变化

如图5所示, MBM替代10%—30%的鱼粉时,肝脏甘油三酯含量均显著高于MBM0组(P<0.05),总胆固醇含量呈下降趋势, MBM20组和MBM30组显著低于MBM0组, MBM20组最低(P<0.05)。如表7所示, 肝脏甘油三酯与MBM替代比例呈极显著正相关关系(P<0.01)。总胆固醇与MBM替代比例呈极显著负相关关系(P<0.01)。

表7 MBM替代比例与卵形鲳鲹肝脏脂质成分的相关性分析Tab.7 Correlation between MBM substitution ratio and liver lipid composition of Trachinotus ovatus (n=3)

图5 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹肝脏生化指标的影响Fig.5 Effects of MBM on liver biochemical indices of Trachinotus ovatus

如图6A所示, 从肝组织H&E切片可以看出,MBM0组肝细胞形态正常, 细胞间界限明显, 细胞核清晰可见。但随着MBM替代鱼粉比例的升高,肝细胞形态轮廓逐渐模糊, 细胞核减少。如图6B所示在相同倍镜视野内替代鱼粉正在10%—30%的组, 肝脏空泡化面积显著高于MBM0组(P<0.05), 统计分析结果显示MBM10组空泡面积百分比最高。

图6 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹肝脏的影响(×200)Fig.6 Effects of MBM on liver of Trachinotus ovatus (×200)

3 讨论

3.1 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹生长性能和脂质沉积的影响

单细胞蛋白的来源主要为藻类、真菌和非致病性细菌等单细胞微生物[13], 早在20世纪80年代中期, 就在食品加工和饲料生产中得到普遍应用。单细胞蛋白的粗蛋白含量可达50%—85%, 氨基酸构成丰富且均衡, 与鱼粉氨基酸组成相似, 可利用率高[13,14]。荚膜甲基球菌是一种非致病性的革兰氏阴性菌, 普遍存在于土壤等环境中, 可利用甲烷、甲醇和甲醛等碳源作为能源, 发酵形成MBM, 其与鱼粉相比, 粗蛋白和核酸含量更高, 研究发现MBM替代鱼粉比例为9%时, 大比目鱼(Hippoglossus hippoglossus)生长性能与对照组无显著性差异, 超过18%后生长新能开始下降[15]。本实验结果显示, 随着饲料中MBM替代比例的升高, 各实验组卵形鲳鲹肠道胰蛋白酶活性和脂肪酶活性无显著性差异,终末均重、存活率、增重率、特定生长率、脏体比和饲料系数等指标均未产生显著变化, 这与MBM替代鱼粉在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[16]和凡纳滨对虾[9]实验结果一致。在MBM替代鱼粉后, 卵形鲳鲹对饲料蛋白和脂质的消化能力及生长性能未造成负面影响, 这可能是因为MBM的氨基酸组成均衡[17], 且与鱼粉相似。肥满度可用于评价机体生长和摄食等状况[18], 在本实验条件下, 肥满度整体呈现出上升的趋势, MBM30显著高于对照组, 饲料系数和摄食率各组间均无显著性差异, 但呈下降趋势;增重率无显著性差异, 由肥满度计算公式可知, 所以在相同体重下。体长越小, 肥满度越大, 因此MBM替代鱼粉后鱼体长生长小于对照组, 表明MBM替代部分鱼粉可使鱼体型更加肥满。

鱼类摄食饲料会对其机体成分产生一定程度的影响[19]。在本实验中, MBM替代不同的水平的鱼粉并未对卵形鲳鲹全鱼和背肌的水分及全鱼的粗蛋白产生显著的影响。然而, 卵形鲳鲹全鱼和背肌粗脂肪含量随着MBM替代鱼粉比例的提高而有上升趋势, 这与肥满度的趋势一致。MBM的氨基酸组成和鱼粉相近, 饱和脂肪酸含量高于鱼粉[17],有研究表明, 大口黑鲈对MBM的表观消化率略高于鱼粉[20], 结合本研究结果推断, MBM替代鱼粉可能影响机体脂质的利用。MBM不饱和脂肪酸含量不及鱼粉的多[17], 因此鱼体摄入饱和脂肪酸相对增多[21], 导致在鱼体脂肪及肌间脂肪含量上升, 从而提高肥满度, 并且可提升鱼肉保水性和嫩滑的口感。在肝脏中, 随着替代量的增加, 总胆固醇无显著变化, 但是甘油三酯的含量显著升高, 通过皮尔森相关性分析可知, 肝脏中甘油三酯含量与MBM替代比例呈正相关关系, 总胆固醇呈负相关关系,这与血清中相反, 提示总胆固醇优先于甘油三酯转运到血液中参与循环代谢, 甘油三酯在肝脏储备。与MBM0组相比, 替代鱼粉达10%—30%组的鱼体肝细胞都存在空泡化现象, 还观察到肝细胞核减少。在发酵豆粕高水平替代鱼粉后, 大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼肝细胞崩解剧烈, 细胞核大面积消失[22], 高糖饲料导致糖类在卵形鲳鲹幼鱼肝脏转化为脂肪, 使肝脏的空泡面积增加[23]。结合血清指标和生长性能数据分析, MBM替代鱼粉水平升高会使卵形鲳鲹的肝脏产生一定程度的脂肪蓄积,但是对鱼体的生长性能无显著影响。

鱼类的血液指标与鱼体的营养健康状况紧密相关。本试验中MBM20和MBM30组血清甘油三酯含量均显著低于MBM0组, 表明饲料中添加MBM替代鱼粉达20%—30%时有利于降低血清中甘油三酯的含量。在本实验中, 随着MBM替代鱼粉水平的升高, 卵形鲳鲹各组间谷丙转氨酶活性没有显著变化, 血清谷草转氨酶活性在MBM20组显著升高, 在对五条鰤的实验结果显示, 谷丙转氨酶各组间无显著性差异, 替代量为20%时谷草转氨酶显著低于其余各组[11], 相对于MBM0组、MBM20和MBM30组对卵形鲳鲹血清总蛋白和白蛋白含量的变化并不显著, 血清总蛋白和白蛋白含量以及转氨酶活性均可以作为肝功能变化的指标[24—26]。综上, 本实验结果表明替代20%—30%鱼粉后, 卵形鲳鲹的肝脏功能有一定程度的影响, 但是血清指标的综合显示这种变化不影响整体代谢。

3.2 MBM替代鱼粉对卵形鲳鲹抗氧化能力的影响

生物体内的抗氧化酶可以保护细胞抵抗自由基造成的氧化损伤[27], 从而起到维持机体正常生理功能的作用[28]。超氧化物歧化酶在鱼体内可以起到清除超氧阴离子自由基和预防生物分子损伤的作用, 丙二醛是脂质过氧化的最终分解产物, 在生物体内含量过高对机体有毒害作用[29,30]。已有研究表明, 在饲料中添加MBM能提高建鲤(Cyprinus carpiovar.Jian)和吉富罗非鱼(GIFT)血清中的总抗氧化能力并降低丙二醛含量, 对超氧化物歧化酶无显著性影响[31,32]; 而不同含量MBM的各饲料处理组间黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)血清超氧化物歧化酶和丙二醛则无显著性差异[33]; 对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的研究则显示这3个指标皆随MBM替代鱼粉的比例升高而增高[9], 因此不同物种以及饲料配方的组成均可对MBM 的使用产生不同的效果。本实验中, MBM20组肠道超氧化物歧化酶活性显著高于MBM0组, 血清和肝脏总抗氧化能力与MBM0组相比无显著性差异, MBM20组血清, 肠道和肝脏丙二醛含量与MBM0组相比亦无显著差异, 即替代20%的鱼粉时, 可以起到提高鱼肠道清除超氧阴离子的能力, 效果优于低替代量和高替代量。

4 结论

本实验结果表明, 当基础饲料中鱼粉含量为35%时, 荚膜甲基球菌蛋白添加量为7%—10.5%, 替代鱼粉的比例为20%—30%时, 可以提高全鱼和肌肉的脂肪含量, 肝脏空泡化程度显著增加但不会对卵形鲳鲹幼鱼的生长和抗氧化能力产生负面影响。