百香果香气成分的气相色谱-嗅觉-质谱分析

顾钰宸，冯 涛

（上海应用技术大学香料香精化妆品学部，上海 201418）

百香果（Passiflora eduliaSims）是一种西番莲科植物，大量种植于热带和亚热带地区，有“果汁之王”的美誉[1]。百香果的果实具有独特的香气，是天然浓缩汁和天然香料[2-3]。香气是评价其品质的关键特征之一，它混合了番石榴、芒果、苹果、香蕉、荔枝、草莓、柠檬和菠萝的香气[4]。此外，百香果富含大量多酚、黄酮、类胡萝卜素、维生素C等活性物质[5]。

目前对百香果的研究主要集中在其抗氧化[6-7]、抗炎[7-8]、降血糖[9]等药理作用上，对其挥发性香气化合物的研究较少。Li 等[4]使用HS-SPME-GC/MS 结合转录组分析方法对百香果成熟过程中香气形成机制进行研究，分析了不同成熟阶段的百香果果实挥发性化合物，发现随着百香果的成熟，其香气会急剧增加。Md 等[10]采用1H NMR 结合化学计量学分析方法，对不同成熟阶段采收的百香果代谢产物进行了分析，发现所有代谢物都相互关联，最终导致百香果的成熟。

气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和嗅辨仪（olfactometer，O）常被联合用于表征并鉴定不同种类样品中的挥发性香气化合物[11-13]。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）与溶剂辅助风味蒸发（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）是较为常用的提取样品中香气化合物的前处理方法[14-20]。如今，香气提取稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）与气相色谱-嗅觉-质谱仪（gas chromatography-olfactometry-massspectrometry，GC-O-MS）相结合的应用已成为识别和表征许多食品中香气活性化合物的有效方法[21-23]。然而，目前这种复杂的方法尚未应用于百香果挥发性香气化合物的鉴定。

本研究旨在找到适合百香果香气的提取方法并测定百香果中的香气成分。首先使用AEDA 的方法鉴定不同提取方法得到的百香果香气化合物，之后定量香气化合物并计算OAV，最后进行香气重组与缺失试验，从而为百香果产品质量控制和工艺改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百香果，广西桂平；NaCl、NaOH、葡萄糖和酒石酸，分析纯，北京化学试剂公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE（1 000 mg 填料），天津博纳艾杰尔科技有限公司；D-葡萄糖酸内酯、聚乙烯基吡咯烷酮和C6～C30正构烷烃，美国Sigma 公司；香气标准品，美国Sigma 公司和瑞士Fluka 公司。

1.2 仪器与设备

嗅辨仪（olfactory detection port，ODP），德国Gerstel 公司；溶剂辅助风味蒸发装置（SAFE），德国Glasbläserei Bahr 公司；Agilent 7890 GC 气相色谱仪、Agilent 5975B MS 质谱仪，美国安捷伦科技有限公司；DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取头，美国Supelco 公司；DB-Wax 气相色谱柱、HP-INNOWax 气相色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），美国J&W Scientific 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

（1）SPME

医院通过办公自动化,强化对网络安全管理,培养专业档案人才,制定档案管理标准,工作效率出现显著提升,而且整体操作规范统一。详情见下表1。

称取5 g 百香果香料和1 g NaCl 快速放入萃取瓶中，将装有样品的萃取瓶放入50 ℃的恒温水浴锅中平衡20 min，用SPME 萃取头扎入萃取瓶中同样温度下萃取30 min。提取后，将纤维转移到进样口，在250 ℃下解吸5 min，用于GC-MS 分析。

（2）SAFE

准确称量20 g 百香果香料于500 mL 锥形瓶中，加入200 mL 二氯甲烷，在磁力搅拌器上提取1 h，转置于分液漏斗中，上层液体置于500 mL 圆底烧瓶中，保留下层液体并转移至锥形瓶中，以相同步骤再重复2 次后将3次上层液体合并于圆底烧瓶，得到的提取液在SAFE 装置中进行提取。馏出物用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪上浓缩至5 mL，然后在温和的氮气流下进一步浓缩至200 μL。在GC-MS 和GC-O 分析前，浓缩于-20 ℃保存。

1.3.2 GC-MS 测定条件

采用DB-Wax 气相色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度230 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min；以4 ℃/min 上升至120 ℃，保持6 min；再以10 ℃/min 上升至230 ℃，保持6 min；载气为氦气；柱内载气流量1 mL/min；不分流。电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度150 ℃；溶剂延时5 min；倍增器电压1 964.7 V，扫描范围20～400 amu。

1.3.3 GC-O-MS 测定条件

HP-INNOWax 气相色谱柱（60 m×0.25 mm,0.25 μm），载气为氦气，流速1 mL/min。进样量为1 μL，不分流进样。程序升温：起始温度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至230 ℃，保持15 min。进样口和辅助加热区的温度均为250 ℃。样品经色谱柱分离后以1∶1 比例分别进入质谱和ODP 进行检测。离子源为EI 源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为30～350m/z。质谱接口温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃。

将提取物用二氯甲烷溶剂逐步稀释，由1∶2、1∶4、1∶8 直至1∶1 024。在上述GC 条件下，使用DB-Wax色谱柱通过GC-O 对每个稀释样（1 μL）进行分析，每个样品及其每个稀释度均由3 名经过半年以上闻香培训的闻香员进行嗅辨分析，有两位及以上闻香员嗅闻到的香味的化合物则计算其稀释因子，直到无法检测到任何香气化合物为止。每种化合物的风味稀释度（flavor dilution，FD）因子表示可以感知到的最大稀释度。通过将其气味、保留指数（retention index，RI）和质谱与真实化合物的气味进行比较，识别每种气味。

1.3.5 香气重组试验

AV 是香气物质的浓度与阈值之比，表示特定气味的效力，一般OAV＞1 则被认为是主要香气。将百香果中FD≥8 或OAV≥1 的香气化合物按其实际浓度混合在空白基质中作为重组模型，将其与未经处理的百香果香料香气进行比较。小组人员共同讨论得出6 个不同香气类型用于描述百香果香气，随后对样品的不同香气类型进行了强度评估，以确定这些香气化合物对百香果整体香气贡献的影响。

1.3.6 缺失试验

根据香气类型及化合物类别将上述香气化合物分组，设计缺失试验验证单一组分对百香果的香气贡献。试验需要用到缺失某一种香气组分的缺失模型与2 个完整的香气重组模型。所有样品都标有三位数代码并以随机的顺序呈现给专家小组成员进行三角测试，小组成员需要区分出缺失模型与2 个完整的香气重构模型，确定缺失模型和重构模型差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 百香果挥发性香气化合物的识别

通过SPME 鉴定共检测到71 种挥发性组分（见下页表1），其中酚类7 种、脂肪酸乙酯类7 种、脂肪酸类6种、高级醇类5 种、C6醇类5 种、内酯5 种、醛酮类3 种、硫化物2 种、高级醇乙酸酯类2 种、C13-降异戊二烯1 种以及其他类3 种。FD 值大于1 024 的香气物质有β-大马士酮、己酸、β-苯乙醇和4-乙基苯酚。

表1 利用AEDA-GC-O-MS 鉴定百香果香料关键香气活性物质Table 1 Identification of key aroma active substances in passion fruit spices using AEDA-GC-O-MS

续表

在SAFE 提取物的香气化合物中，共嗅闻到39 个香气区域，其中23 个香气区域可实现化合物的定性，与SPME 中香气物质相似，仍有16 个香气区域未被鉴定。鉴定的23 种香气物质中，包括挥发性酚类8 种、内酯4种、脂肪酸类3 种、高级醇类2 种、醛酮类2 种、C13-降异戊二烯1 种、C6醇类1 种、硫化物1 种以及其他类1 种。其中，β-苯乙醇（玫瑰、花香）、愈创木酚（甜香、焦糖味）具有最大的FD 值（FD＞1 024），其次为γ-壬内酯（甜香、焦糖味、果干），FD 值达512。另外，4-乙基苯酚、异丁香酚、β-大马士酮、己酸、对甲酚、间甲酚、4-乙烯基愈创木酚、紫丁香酚、甲硫基丙醛、γ-丁内酯、香草醛、双乙酰、苯乙醛、异戊酸及14 种未知化合物的FD 值也都不低于8。

总体上，利用AEDA-GC-O-MS 技术鉴定了由SPME 和SAFE 萃取样品中的关键香气物质共71 个香气区域，每个香气区域均由两位及以上的专业品评员共同嗅闻确定。其中47 个香气区域能够实现香气物质的鉴定，但仍有24 个香气区域无法鉴定，这可能与上述化合物为痕量物质或存在共流出现象有关。高级醇物质是百香果重要的风味物质化合物，在百香果中共检测到高级醇类物质5 种；其中β-苯乙醇具有最大FD 值（FD＞1 024），其次为异戊醇，FD 值达512。脂肪酸乙酯类物质主要表现为果香，其中辛酸乙酯的FD 值达512，除苯乙酸乙酯外，其他脂肪酸乙酯类香气物质的FD 值均在8～128 之间。高级醇乙酸酯类物质主要贡献花香和果香，其中乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯的FD 值均不低于8。挥发性酚类物质中4-乙基苯酚具有最大FD 值（FD＞1 024），在嗅闻过程中表现为动物味、马厩味和皮革味；另外，4-乙烯基愈创木酚（李子干、肉桂）、丁香酚（李子干、香料）、愈创木酚（甜香、烟熏）和对甲酚（动物味）也都具有较大的FD 值。脂肪酸类物质主要表现为脂肪味和酸腐味，其中己酸具有最大FD 值（FD＞1 024），除辛酸外，其他脂肪酸类香气物质的FD 值均在16～256 之间。C13-降异戊二烯对果实的花香、果香贡献最大。本试验中嗅闻到的C13-降异戊二烯中FD 值最大的为β-大马士酮（FD＞1 024），嗅闻过程中表现为花香、甜香和蜂蜜味。C6醇类物质对香气的贡献也比较大，嗅闻过程中主要表现为生青味，1-己醇、顺式-3-己烯醇、反式-3-己烯醇、顺式-2-己烯醇以及反式-2-己烯醇的FD 值均不低于8。

除上述物质外，百香果还鉴定出了内酯、硫化物、醛酮类物质等，也对香气有较大贡献。内酯主要为γ-丁内酯（烘烤味、烤杏仁）、γ-己内酯（黄瓜、植物味）、γ-辛内酯（花香、椰子）和γ-壬内酯（甜香、焦糖味、果干），它们的FD 值均不低于8。硫化物在嗅闻过程中表现为煮土豆味，甲硫基丙醇和甲硫基丙醛的FD 值分别为8 和128。醛酮类物质也称羰基化合物，既可能来源于果实，也可来源于微生物代谢，其中双乙酰表现为黄油味、酸奶味，FD 值达512；苯乙醛表现为玫瑰花香，FD 值为128。此外，麦芽酚（甜香、焦糖味）和香草醛（香草味）的FD 均不低于8，对香气有一定贡献。在未知化合物中，未知物1533 和1901 的FD 值为256，而未知物2246 和2257 的FD 值也可达128，对百香果整体香气可能有较大贡献，但需要提高色谱的分离度或质谱的分辨率对未知嗅闻区域的物质做进一步定性分析。

2.2 百香果挥发性香气成分的定量及OAV 的计算

对百香果中的挥发性香气成分进行OAV 的计算，筛选出OAV＞1 对香气有贡献的成分。

由表2 可知，由SPME 方式萃取的百香果香料中香气化合物含量最高的为乙酸，其次为异戊醇，含量分别为676.44 mg/L 和177.11 mg/L，分别占香气物质总量的55.58%和14.55%。另外，乳酸乙酯、2,3-丁二醇、异丁醇、γ-丁内酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇、1-己醇、异丁酸、辛酸、己酸、癸酸、辛酸乙酯和丁酸的含量均超过1 mg/L。

对定量的香气化合物进行OAV 分析，具体结果见表2。OAV 大于1 的游离态香气化合物共有23 种，包括脂肪酸乙酯7 种、脂肪酸类6 种、高级醇类3 种、醛酮类2种、高级醇乙酸酯1 种、其他酯类1 种、C13-降异戊二烯类1 种、C6醇类物质1 种和硫化物1 种。根据OAV 结果发现，β-大马士酮（OAV=707.80）、苯乙醛（OAV=164.10）和己酸乙酯（OAV=112.20）的OAV 较高，可能对百香果的香气特征有较大贡献。高级醇类物质中的异戊醇、β-苯乙醇、异丁醇和脂肪酸类物质中的辛酸、己酸、乙酸的OAV 均大于1。虽然乙酸和异戊醇的含量最高，但其OAV 并不高，仅为3.38 和2.72。这说明香气化合物的含量并不能完全反映其对百香果香气的贡献。

表2 基于SPME、SAFE 前处理后样品中香气物质的OAV 计算Table 2 OAV calculation based on aroma substances in samples after SPME and SAFE pretreatment

百香果中的酯类物质的含量常超过其感官阈值，可以赋予百香果浓郁的果香和甜香。本试验中鉴定出的酯类物质主要为脂肪酸乙酯类，含量在0.003～115.39 mg/L之间，其中己酸乙酯具有最大的OAV，达112.20；另外，乙酸异戊酯、乙酸乙酯以及乳酸乙酯的OAV 均大于1。醛酮类物质苯乙醛的OAV 仅次于β-大马士酮（OAV=161.40），而该物质在GC-O 分析中也具有较大的FD 值。另外，辛酸、癸醛、乳酸乙酯、癸酸乙酯的FD 值均小于8，但它们的OAV 值均超过1。由此可见，在GC-O稀释分析与OAV 分析鉴定重要化合物时存在一定差异。百香果中OAV 大于1 的结合态香气化合物共有10 种，包括挥发性酚类4 种、脂肪酸类2 种、醛酮类2 种、硫化物1 种和C13-降异戊二烯类1 种。

2.3 香气重组与缺失实验

FD 值和OAV 的分析结果确定了影响百香果香气的关键香气物质。然而，挥发性化合物之间的相互作用没有考虑在内。为了验证上述主要香气化合物对百香果整体香气的贡献，对百香果香料及香气重构模型进行定量描述分析。采用FD≥8 或OAV≥1 的42 种香气物质进行香气重构分析，重构模型由模拟溶液与42 种化合物组成，见图1。

图1 百香果香料与重构香料香气轮廓分析Fig.1 Aroma profile analysis of passion fruit spices and reconstituted spices

百香果香料及重构模型的得分情况如图1 所示，在6 种香气中，果香、甜香和花香有较强的香气强度，而酸香、柑橘香和青草香不太明显。另外，通过重构试验发现重构模型与原样相比，香气轮廓基本一致，但是重构模型的香气强度均低于原样，可能是由于在GC-O 分析实验中，存在许多未被鉴定的FD 值较大的嗅闻区域，而这些化合物未被添加进重构模型所造成的。

为了验证上述香气化合物对百香果香气轮廓的影响，根据香气类别及化合物类型将上述香气化合物分成5 组，建立5 组缺失模型，缺失物质分为酯类物质、β-大马士酮、挥发性酚类物质、C6醇类物质和脂肪酸类物质。分别缺失这5 组香气化合物，通过三角检验对比缺失香气与未缺失香气的重构模型之间是否存在差异，来确定其对整体香气的贡献，缺失试验结果如表3（见下页）所示。

表3 百香果香料缺失试验结果Table 3 Results of passion fruit spice deficiency experiment

由表3 可知，酯类物质、β-大马士酮及C6醇类物质的缺失组与未缺失组之间存在极显著的差异（P＜0.001）。挥发性酚类物质很显著影响百香果香料的香气感知（P＜0.01），这些物质主要赋予百香果水果味、香料味及甜味，这类香气在重构时也与百香果轮廓较为相似，进一步说明挥发性酚类物质是百香果香料的特征香气物质。脂肪酸类物质对其的香气感知也有显著影响（P＜0.05），在嗅闻过程中主要表现为脂肪味、酸腐味，虽然不是百香果香料主要的香气轮廓，但缺失检验显示其对百香果香料的香气存在影响。

3 结论

本研究证明了固相微萃取和溶剂辅助风味蒸发是提取百香果香气化合物较好的方法。通过香气提取物稀释分析共识别出71 种百香果香气化合物，对它们进行定量，并计算气味活性值。其中β-大马士酮的FD 因子与OAV 值最高，可被认为是百香果香气最重要的贡献物。把FD≥8 或OAV≥1 的化合物进行香气重组与香气缺失试验，结果表明重组模型与百香果香气没有明显差异且5 组香气化合物对百香果香气存在影响。本研究弥补了百香果香气化合物研究方向的空白，为百香果的产品质量控制和工艺改进提供了参考。