马郁兰精油对大鼠力竭游泳导致的运动性疲劳不具有改善作用

张 伟,周嘉恒,胡 扬,蔡文泳，李庆喆,杨红燕,张衍鹏，董 玲

(1空军军医大学航空航天医学系飞行人员疗养与康复教研室，陕西 西安 710032；2西北大学生命科学学院组织工程实验室，陕西 西安 710069； 3中国人民解放军第94521部队，山东 淄博 255399)

军事训练是部队士兵在和平时期的主要任务，高强度、长时间的负荷训练极容易导致士兵产生运动性疲劳。疲劳状态会影响人体功能及思维判断，极易导致军事训练伤的发生，降低部队的作战能力[1]。军事训练伤的发生不仅降低训练效率，还可能造成官兵的心理和生理问题[2]。运动性疲劳是机体生理不能维持其机能在特定水平上或不能维持预定的强度[3]。研究表明，运动性疲劳会导致内分泌系统功能障碍、免疫力下降、失眠、抑郁等不利的生理反应[4-5]。此外，士兵训练期间的长时间剧烈运动会导致心脏运动性疲劳[6]。因此，缓解训练导致的运动性疲劳，促进官兵身体各项机能的恢复，以提高训练效果和战斗力、减少军事训练伤的发生具有重要意义。目前，有冷疗、温水浴、营养补偿、按摩和药物等治疗方法[7-8]。但由于现有的运动性疲劳恢复方法有着器材价格高昂、使用时间及剂量难确定等局限，因此寻求便捷、有效的手段一直被广大官兵和运动生理学家所重视。

芳香精油是指用有机溶剂萃取、机械压榨或蒸馏的方法从芳香植物的根、茎、叶、花、果和种子中获取具有芳香气味的精油。运用香熏、按摩和沐浴等方法可使精油通过嗅吸和渗透皮肤的途径作用于人体，从而对人在生理和心理上进行调整。马郁兰为唇形科牛至属多年生草本植物，其野生资源在我国十分丰富，可用于食品、药用、化妆品等方面。马郁兰精油可消除肌肉疼痛、促进血液循环和舒缓焦虑、压力，具有消除身心疲劳的作用[9]。然而关于马郁兰精油对运动性疲劳影响的相关研究未见报道。因此，本研究采用负重强迫游泳运动诱导大鼠运动性疲劳模型，给予大鼠游泳运动前雾化吸入马郁兰精油，探究马郁兰精油是否具有缓解运动性疲劳的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验采用6周龄SD雄性大鼠60只，体质量170～210 g，购自空军军医大学实验动物中心。适应性饲养3 d后，大鼠游泳学习3 d，20 min/d。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析 将马郁兰精油(多特瑞商贸有限公司，上海)送往南京大学现代分析中心检测成分及含量。马郁兰精油经GC-MS联用仪(QP-2020，日本岛津公司)进行定性定量分析。气相色谱条件：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温(初始柱温为60 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升至280 ℃)；载气为氦气，载气流速为1.0 mL/min；分流比为80∶1；进样体积0.2 μL。质谱条件：电离方式为电子电离，电离能量70 eV，离子源温度为220 ℃，质量扫描范围(m/z)为20～500。根据GC峰面积用归一化计算精油中各成分的百分比。采用NIST2017谱库检索、标准品比对，并结合保留指数等手段进行定性分析。

1.2.2 大鼠吸入马郁兰精油剂量的测定 参照参考文献 [10] 确定评估SD大鼠吸入雾化马郁兰精油的最适剂量。使用压缩空气式雾化器(403M，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)以压缩泵产生压缩空气为驱动使马郁兰精油雾化。为评估大鼠马郁兰精油的耐受剂量范围，采用随机数表法将它们分为以下实验组并吸入不同剂量雾化马郁兰精油：对照组(0 μL/h)和4组梯度剂量组(剂量分别为4、40、400、4 000 μL/h，每组8只大鼠)。将同组大鼠置于独立通风动物笼盒(BCR-RI01-PEI，山东新华医疗器械股份有限公司，450 mm×275 mm×234 mm)。按分组通入不同剂量雾化精油15 min后进行负重游泳运动，观察每只大鼠游泳动作并记录每只大鼠游泳力竭时间用以评估精油的最适剂量。

1.2.3 负重游泳实验和剂量测定 采用负重游泳的方式测量大鼠力竭时间[10]。各组动物均采用尾部缚铅球砝码(约大鼠体质量的5%)的方法负重，负重后大鼠在高65 cm、直径50 cm的圆形塑料桶中自由游泳，静水深40 cm，水温(34.0±2.0)℃。大鼠游泳力竭后立即捞出。大鼠力竭游泳的判断标准为：大鼠在水中运动协调性下降且水淹没大鼠鼻尖至大鼠再次浮出水面超过10 s[11]。对照组和4组梯度剂量组大鼠游泳力竭时间分别为(10.32±1.42)、(22.57±5.96)、(14.69±2.36)、(12.31±1.91)和(6.33±0.74)min。40、400、4 000 μL/h剂量组的游泳力竭时间较对照组无显著差异(P>0.05)，4 μL/h剂量组的力竭时间显著高于对照组(P<0.05)。基于以上结果，本实验选择低剂量(4 μL/h)开展后续研究。

1.2.4 大鼠运动性疲劳模型的建立 采用连续负重强迫SD大鼠游泳2周建立运动性疲劳模型[11]。使用随机区组法将SD大鼠分为负重强迫游泳(weight-loaded forced swimming test, WL-FST)组和负重强迫游泳+马郁兰精油处理(weight-loaded forced swimming test+marjoram essential oil，WL-FST+MEO)组，每组10只大鼠。分别给予WL-FST组每日负重3%游泳90 min，游泳前吸入15 min雾化生理盐水；WL-FST+MEO组每日进行负重3%游泳90 min，游泳前吸入15 min雾化马郁兰精油(4 μL/h)处理。

1.2.5 抓力、血压、力竭运动时间测试和行为学实验

1.2.5.1 抓力测试 使用小动物抓力计(ZS-ZL，北京众实迪创科技发展有限责任公司)测量大鼠最大抓力。轻提大鼠尾部使大鼠身体与抓力计网面呈15°夹角，使其前爪落在网面向后拉大鼠，记录抓力，每只大鼠测量3次，取其平均值。

1.2.5.2 血压测试 使用智能无创血压计(softron bp 2010A，北京软隆生物科技有限公司)测量大鼠血压。按照仪器使用说明将保温筒预热到39 ℃将大鼠放入鼠袋。监测大鼠尾部血流脉冲波形稳定后开始测量，记录收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)和心率(heart rate，HR)。

1.2.5.3 力竭运动时间测试 大鼠负重5%体质量，游泳至力竭，记录力竭运动时间。其余操作及条件同运动性疲劳模型的建立。

1.2.5.4 行为学实验 使用行为学视频分析系统(JLBehv-OFG-4，上海)进行大鼠旷场的行为学检测。大鼠置于行为学实验室适应性训练2 d后进行旷场实验，旷场规格为80 cm×80 cm×50 cm，底部及四周为黑色木板。实验时大鼠被单独安置在旷场的一角，使其在旷场中自由探索5 min，记录大鼠5 min内在旷场运动轨迹[12]。

1.2.6 血清生化指标检测 大鼠游泳至力竭后，立即捞出注射30 g/L戊巴比妥麻醉(60 mg/kg)。心尖取血，室温静置20 min后4 ℃离心15 min(3 500 r/min)，取上清待测，于-80 ℃冰箱冷藏。葡萄糖(glucose，GLU)采用葡萄糖氧化酶法测定，游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)采用酶法测定，肌酸激酶(creatine kinase，CK)采用磷酸肌酶底物法测定，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)采用乳酸底物法测定。试剂盒采购于南京建成生物工程研究所，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 电镜实验 取大鼠左心室室壁组织，并切成1 mm×5 mm大小,置于固定液(20 mL/L甲醛和25 mL/L戊二醛混合液)中4 ℃冰箱过夜，制作电镜样本备用。0.1 mol/L BP缓冲液冲洗样本10 min；10 mL/L锇酸浸泡90 min；再次用0.1 mol/L BP缓冲液冲洗样本10 min；分别用500、700、800、900、950 mL/L乙醇依次脱水8 min，无水乙醇脱水25 min，丙酮脱水20 min；环氧树脂包埋过夜；60 ℃纯聚合24 h；样品铅铀染色10 min，制备超薄切片；透射电子显微镜(JEM-1230，日本电子株式会社)扫描并拍照。

2 结果

2.1 马郁兰精油成分及含量

利用GC-MS对精油的挥发性化学成分进行分析鉴定，得到马郁兰精油色谱图(图1)并鉴定出56种化学成分，占精油总成分的99.97%。马郁兰精油中含量1%以上的成分有16种，分别为4-萜烯醇(23.98%)、水合沙比宁(14.59%)、γ-萜品烯(13.22%)、α-松油烯(8.03%)、桧烯(7.47%)、α-松油醇(3.50%)、顺式水合桧烯(3.27%)、萜品油烯(3.09%)、石竹烯(2.87%)、β-水芹烯(2.77%)、顺式-4-(异丙基)-1-甲基环己-2-烯-1-醇(2.51%)、月桂烯(1.85%)、乙酸芳樟酯(1.77%)、双环-大根老鹳草烯(1.76%)、邻伞花烃(1.39%)、(R)-(+)-苎烯(1.34%)，占精油总成分的93.41%。

图1 马郁兰精油的总离子流色谱图

2.2 马郁兰精油降低运动性疲劳大鼠血压和HR，并缩短力竭游泳时间

实验结果显示，WL-FST+MEO组大鼠与WL-FST组相比，DBP和HR显著降低(P<0.05，P<0.01，图2)，提示马郁兰精油具有降低血压和HR的作用；两组间抓力无显著差异，提示两组大鼠的肌肉力量水平没有差异；吸入2周雾化马郁兰精油的运动性疲劳大鼠力竭游泳时间显著下降(P<0.01，图2)，提示马郁兰精油降低了运动性疲劳大鼠的运动表现。

A～C：负重游泳2周后大鼠的SBP、DBP和HR；D：负重游泳2周后大鼠的抓力；E：力竭运动后大鼠力竭时间。SBP：收缩压；DBP：舒张压；HR：心率；WL-FST：负重强迫游泳(n=8)；WL-FST+MEO：负重强迫游泳+马郁兰精油处理(n=9)。 aP<0.05， bP<0.01。

2.3 马郁兰精油未改善大鼠运动性疲劳后血清的GLU、FFA含量及CK、LDH活力

运动性疲劳的产生机制有多种学说和理论，其中衰竭学说认为在运动过程中体内能源物质大量消耗导致能量短缺，从而造成肌肉不能维持工作强度。此外，堵塞学说认为运动时机体能量代谢增强，造成乳酸、酮体等代谢物质在体内堆积，导致肌肉等组织功能下降。本实验中血清测试结果显示，游泳力竭后两组大鼠血清中GLU、FFA含量及CK、LDH活力均无显著统计学差异(图3)。提示马郁兰精油对大鼠运动能力的影响与能量物质消耗和代谢物质堆积无明显相关性。

A：GLU含量；B：FFA含量；C：CK活力；D：LDH活力。GLU：葡萄糖；FFA：游离脂肪酸；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脱氢酶；WL-FST：负重强迫游泳；WL-FST+MEO：负重强迫游泳+马郁兰精油处理。n=6。

2.4 马郁兰精油增加疲劳大鼠的焦虑样行为

旷场实验是检测啮齿类动物自主活动度的一种重要手段，主要通过受试动物在旷场中的活动量来评价动物对外界的认知能力、兴奋性和抑郁等[13]。旷场实验结果显示，与WL-FST组相比，WL-FST+MEO组大鼠在旷场中移动的总距离、中央区域移动速度、平均移动速度和边缘移动总距离均无显著性差异，但中央区域移动距离和滞留时间显著降低(P<0.05，图4)。

2.5 马郁兰精油不能改善运动性疲劳大鼠心肌细胞结构的损伤

透射电镜扫描结果显示，两组大鼠心肌细胞的线粒体中均出现嵴间隙增宽、断裂或溶解呈空泡状，部分线粒体分布散乱的现象。与WL-FST组相比，WL-FST+MEO组中心肌细胞损伤更严重(图5)。

A：旷场实验轨迹图；B：旷场实验总移动距离；C：旷场实验平均移动速度；D：旷场中央区域移动距离；E：旷场中央区域平均移动速度；F：旷场中央区域滞留时间；G：旷场周边区域移动距离。WL-FST：负重强迫游泳(n=8)；WL-FST+MEO：负重强迫游泳+马郁兰精油处理(n=9)。 aP<0.05， bP<0.01。

WL-FST：负重强迫游泳；WL-FST+MEO：负重强迫游泳+马郁兰精油处理。n=3，标尺为1 μm，×15 000。

3 讨论

军事训练中高强度剧烈运动引起的疲劳与机体运动能力降低密切相关，过量运动甚至导致各种运动疲劳、损伤甚至疾病。因此，探究消除高强度、高负荷、长时间军事训练带给士兵的负面影响，寻找抗运动性疲劳的疗法变得越来越重要。芳香疗法是用于恢复健康的一种常见的补充治疗方法，是指利用按摩、沐浴、熏香和食用的方式将从芳香植物中提取的精油通过皮肤、呼吸道或消化道输送到体内，使人在生理和心理方面获得疗效[14-15]。其中，KWON等[16]研究结果表明，与没有接受任何治疗的人相比，接受芳香精油的锻炼者的效果更好，芳香精油在运动中诱导了积极的情绪，减少了运动中的疲劳，并改善了参与者在恢复期的感觉，香气对锻炼者的感觉有重要影响，它可以积极地影响锻炼的满意度和持久性。国内有研究[17]表明，马郁兰精油含有多酚类、生物碱类、皂苷类、萜类等多种抗氧化成分，具有良好的抗氧化活性且抗氧化活性随着浓度增加而增大，其抗氧化机制主要包含清除自由基、抑制自由基生成和激活抗氧化体系等。

在高强度耐力运动中，肝糖原被分解代谢成GLU释放到血液中为肌肉提供能量，如果血液中GLU含量低会导致疲劳[18]。脂肪分解导致脂质代谢成FFA，从而增加其作为能源的利用率。血液中GLU和FFA含量可以作为高强度耐力训练能力的指标。本研究结果表明，游泳后各组的GLU和FFA含量无显著性差异，提示马郁兰精油降低大鼠运动表现与碳水化合物关系不密切。血浆中CK的主要功能是支持产生运动所需的能量，而LDH催化丙酮酸转化为乳酸。高强度负重运动可以显著增加CK和LDH活性，从而降低运动表现[10]。本研究结果表明，两组大鼠血清中的CK和LDH活性无显著差异，提示马郁兰精油降低大鼠运动表现与CK和LDH的代谢无关。本研究中吸入2周雾化马郁兰精油的运动性疲劳大鼠在旷场中的中央区域移动距离和滞留时间显著下降，提示吸入马郁兰精油加剧大鼠焦虑样行为。有研究表明过度训练对心脏的损伤会随着疲劳程度加深，且过度疲劳诱导心肌细胞凋亡、心肌细胞核形态结构异常[19]。心脏电镜扫描结果显示，与WL-FST组相比，WL-FST+MEO组大鼠心肌细胞线粒体中出现嵴间隙增宽、断裂或溶解呈空泡状的表征更明显，提示两组大鼠心肌细胞都有损伤且WL-FST+MEO组大鼠心肌细胞受损更严重，马郁兰精油对运动性疲劳大鼠的心肌细胞损伤无改善作用。

在本实验中，精油对动物的作用可能与人存在差异，需要进一步研究马郁兰精油对人体的影响。研究表明，目前我军各兵种军事训练伤的发生以过度疲劳和急性损伤为主[20]。大鼠游泳疲劳模型是目前国内外有关疲劳研究的动物模型之一。本研究所用的动物模型能部分模拟常规状态下军事训练导致的运动性疲劳，但不能模拟特殊环境且负荷较大的军事训练造成的疲劳，如飞行、核潜艇、航母等任务中超负荷作业、睡眠剥夺和长期精神压力等因素所致的疲劳[1,21]。综上所述，雾化吸入马郁兰精油(4 μL/h，15 min/d，持续2周)后大鼠力竭游泳时间减少、旷场中央区域运动总距离和滞留时间缩短并且心肌结构中线粒体嵴间隙增宽、嵴断裂或溶解呈空泡状的损伤现象更明显。本实验结果提示，马郁兰精油有降低血压和HR的作用，但是不能消除运动性疲劳，使用马郁兰会增加运动性疲劳大鼠的焦虑样行为并加剧运动性疲劳所致的心脏损害。