不同给药方式建立异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化模型的评价

焦浩淼 赵 文

心肌纤维化是多种心血管疾病的共同病理改变之一，如缺血性心脏病、高血压性心脏病、病毒性心肌炎和动脉粥样硬化等，最终会引起心脏功能障碍、心律失常和心力衰竭等严重并发症，具有极高的发生率和危险性[1～3]。预防和逆转纤维化一直是临床治疗心力衰竭过程中的关键，因此，研究心肌纤维化动物模型具有重要的临床意义。

目前小鼠心肌纤维化模型构建主要分为药物和手术两种方式[4,5]。手术方式为主动脉弓结扎手术和腹主动脉结扎术，具有较高的死亡率且实验周期较长[6]。药物主要为皮下植入血管紧张素Ⅱ微量泵和注射异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)，但血管紧张素Ⅱ的不稳定性和半衰期较短的特点降低了模型的成功率[7]。ISO引起心肌纤维化的主要作用机制为促使心肌细胞肥大，进而产生心肌病理性肥厚，长期作用最终引起心肌纤维化，更能真实模拟自然病程[8]。腹腔注射和皮下注射ISO具有操作简单、价格低廉、实验周期短和模型成功率高等特点[9]。但是至今对两种给药方法所构建的小鼠心肌纤维化模型相关指标的差异鲜有报道。本研究分别采用腹腔注射和皮下多点注射ISO两种方法构建小鼠心肌纤维化模型，通过小鼠生存率、心功能受损、组织切片观察和胶原蛋白表达等方面评估两种给药方式的差异，为更好地建立实验动物模型提供参考。

材料与方法

1.实验动物：8～10周龄的SPF级野生雄性C57BL/6J小鼠，体质量为18～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物使用许可证号：SCXK(京)2019-0010。所有小鼠均饲养于SPF级动物房内，小鼠适应3天后进行实验。

2.实验材料与试剂：ISO(批号：A201102)购自美国Sigma Aldrich公司；0.9%氯化钠溶液(批号：C-20082006-1)购自河南科伦药业有限公司；甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)购自北京中杉金桥生物科技有限公司；collagen Ⅰ和collagen Ⅲ抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；通用型组织固定液、蛋白定量试剂盒和组织裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司。

3.实验设计与分组：将60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组A和模型组B，每组各20只。对照组给予腹腔注射0.9%氯化钠溶液，模型组A按5mg/(kg·d)剂量腹腔注射ISO(0.9%氯化钠溶液为溶剂)，模型组B按5mg/(kg·d)剂量皮下多点注射ISO(0.9%氯化钠溶液为溶剂)，ISO实验剂量参考本团队前期实验结果，每日1次，持续21天。实验期间观察小鼠生命体征，并计算不同时间点的小鼠死亡率。

4.观察指标：末次给药24h后，用医用脱毛膏除去小鼠颈部和胸部毛发，将医用耦合剂均匀涂抹于小鼠胸前，手持超声探头(MS-400)，放置于小鼠胸腔部位，观察心脏长轴切面，检测小鼠心功能，通过软件处理分析计算出计算左心室重量(left ventricular mass, LV mass)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左心室短轴缩短率(fractional shortening, LVFS)；称量小鼠的体质量，用4%水合氯醛处理小鼠，取出心脏和肺，滤纸吸去残留的血液，称量小鼠心脏和肺的重量，剥离出胫骨，量取胫骨长度，记录数据，分别计算心脏重量与体质量比率(HW/BW)、心脏重量与胫骨长度比率(HW/TL)和肺脏重量与体质量比率(LW/BW)。

5.Masson染色：将取出的小鼠心脏置于0.9%氯化钠溶液中，排出残留血液，随后放入组织固定液中固定48h。经过组织脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡等步骤，并置于苏木精中浸染10min，随后用蒸馏水冲洗，再用Masson染液浸泡8min，后用2%冰醋酸浸洗适宜时间，分化液分化5min，然后直接用苯胺蓝染液染3min。最后用中性树胶封片。采用徕卡高通量扫描仪对切片进行扫描，并用Image J软件进行分析，观察小鼠心肌纤维化的程度。

6.Western blot法检测：提取各组小鼠心肌组织蛋白，按照Western blot法实验标准操作。

结 果

1.两种不同给药方法对小鼠死亡率的影响：对照组小鼠在21天实验周期内未出现死亡。模型组A小鼠在第0～7天死亡1只，死亡率为5%；第8～14天死亡3只，死亡率为15.79%；第15～21天死亡3只，死亡率为18.75%。模型组B小鼠在第0～14天未出现死亡；第15～21天死亡1只，死亡率为5%。

2.两种不同给药方法对小鼠心功能的影响：末次给药24h后，使用小动物超声仪检测各实验组小鼠的心功能。各组代表性小鼠的M超如图1所示，超声统计结果如表1所示。与对照组比较，模型组A和模型组B小鼠的LV mass明显升高，LVEF和LVFS明显降低(P<0.05或P<0.01)，长时间腹腔注射ISO和皮下多点注射ISO均可诱导小鼠心肌肥大和心功能降低；与模型组B比较，模型组A小鼠LVEF和LVFS均降低(P<0.05)，LV mass升高(P<0.05)，表明模型组A小鼠心功能受损更严重。

图1 各组小鼠心脏超声图实线箭头所示为左心室舒张末期内径，虚线箭头所示为左心室收缩末期内径。A.对照组；B.模型组A；C.模型组B

表1 各组小鼠心脏超声参数比较

3.两种不同给药方法对小鼠HW/BW、HW/TL和LW/BW的影响：末次给药24h后，称量小鼠的心脏和肺，量取小鼠胫骨长度，并进行计算分析，详见表2。与对照组比较，模型组A的HW/BW、HW/TL和LW/BW值均明显升高(P<0.05或P<0.01)，模型组B的HW/BW和HW/TL值均相对升高(P<0.05)；与模型组A比较，模型组B小鼠HW/TL值降低(P<0.05)。以上结果表明，长时间腹腔注射ISO和皮下多点注射ISO均可诱导小鼠心肌肥大和心功能降低，模型组A小鼠出现心力衰竭，影响肺循环，出现了明显的肺水肿，而模型组B则没有出现肺水肿。

表2 各组小鼠HW/BW、HW/TL和LW/BW比较

4.各组小鼠Masson染色结果：Masson染色主要区分心肌纤维和胶原纤维，心肌纤维呈现红色，胶原纤维则呈现蓝色。如图2所示，对照组小鼠心肌纤维排列规则且界限清晰，与对照组比较，模型组A和模型组B的小鼠心肌组织染色结果都出现大量结构紊乱的纤维组织，胶原大量沉积，纤维化明显。定量结果显示，模型组A和模型组B的小鼠心肌纤维化面积均明显增加(P<0.05或P<0.01)，分别增加了59.7%和52.3%。与模型组A比较，模型组B小鼠心肌纤维化面积无明显变化(P>0.05)。长时间腹腔注射ISO和皮下多点注射ISO均可诱导小鼠出现纤维化反应。

图2 各组小鼠心脏组织切片(Masson染色，×200)A.对照组；B.模型组A；C.模型组B

5.各组小鼠心脏组织胶原蛋白表达情况：与对照组比较，模型组A和模型组B的小鼠心肌组织胶原蛋白collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表达量均明显升高(P<0.05或P<0.01)，详见图2、表3。表明长时间腹腔注射ISO和皮下多点注射ISO均可诱导小鼠心肌胶原蛋白异常分泌。

表3 各组小鼠心脏组织胶原蛋白表达情况比较

讨 论

成年哺乳动物的心室心肌主要由心肌细胞和成纤维细胞组成，而成纤维细胞在心肌纤维化进程中扮演重要的角色[10]。心肌成纤维细胞在感染、炎症、代谢失衡和长期负荷等条件下活化为肌成纤维细胞，胶原蛋白分泌异常，胶原逐渐沉积，多余的胶原蛋白增加心室壁的硬度，引起心室重塑，最终阻碍心肌正常的收缩和舒张[11,12]。随着纤维化的发生和发展，心脏功能进一步降低，加重心肌缺血缺氧，破坏心肌收缩力，以致心力衰竭，并引发一系列的并发症，降低患者的生存率[13]。ISO是一种β肾上腺素受体激动剂，已成功应用于构建小鼠心肌纤维化模型中[14]。根据本研究前期模型构建预实验结果，并考虑饲养动物实验成本问题，将实验周期设定为21天。

图3 各组小鼠心脏组织中胶原蛋白表达情况的电泳图1.对照组；2.模型组A；3.模型组B

本研究首先比较了两种给药方式诱导的小鼠死亡率，与模型组A比较，模型组B呈现较低的死亡率，并且随着实验周期延长，模型组A小鼠的死亡率呈现大幅增加，分析原因为腹腔注射ISO引起小鼠腹膜血管扩张，导致腹腔充血；腹腔注射操作不当刺破内脏；模型动物因心力衰竭死亡。与对照组比较，模型组A和模型组B小鼠均出现心脏重量增加，心室腔变大，心功能下降，心肌纤维增生，心肌胶原蛋白表达增加，表明心肌纤维化模型构建成功。心肌组织胶原蛋白定量和Masson染色结果表明，模型组A和模型组B纤维化相关指标比较，差异无统计学意义。同时模型组A小鼠LW/BW值明显升高，出现肺水肿，小鼠已表现出心力衰竭，表明模型组A小鼠心功能受损比模型组B更严重。腹腔注射ISO对小鼠心功能降低更明显，并引发一系列并发症，加快心力衰竭进程。

本研究发现，两种给药方式结果的差异可能是小鼠机体对ISO的药代动力学差异。腹膜表面密布血管和淋巴管，且面积大，具有很强的吸收能力，起效快且作用强烈[15]。皮下结缔组织间隙多，血管少，血流速度慢，药物吸收缓慢，作用维持时间长且可维持稳定的药效[16]。心肌纤维化是一种长期慢性病变结果[17]。腹腔注射ISO方法可能更适用于心力衰竭和急性心肌缺血损伤等模型。本研究在多层面上评价了腹腔注射和皮下多点注射ISO两种方法建立的小鼠心肌纤维化模型，皮下多点注射ISO方法具有较低的死亡率和较高的心肌纤维化发生率，在构建小鼠心肌纤维化模型上效果更好，为研究心肌纤维化提供了很好的实验基础。