NMN长期补充对老年小鼠心功能的影响及机制研究

郭睿青 蔡 玲 张子龙 张小鹏

尽管人类预期寿命不断提高，但许多衰老相关疾病仍不可避免地影响着老年人的生活质量[1]。其中心血管疾病仍然是老年人死亡的主要原因。与年龄相关的心脏功能下降使得老年人口承受着巨大的负担，开发能够改善老年人心脏健康的治疗方法仍然是维持人类健康的首要任务[2]。

心肌细胞具有高密度的线粒体，线粒体内膜上的电子传递链(electron transport chain，ETC)偶联氧化磷酸化产生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)为心肌细胞收缩功能[3]。ETC链上复合体Ⅰ底物分解代谢的辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)也是体内许多脱氢酶的辅酶。然而，在应激和自然衰老过程中，NAD+在组织中的可用性可能会受到限制[4]。因此，挽救细胞线粒体NAD+的水平可能是改善人类衰老相关心脏疾病的有效治疗手段。

哺乳动物中烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)是NAD+重要的前体，其功能也主要通过NAD+体现[5]。花椰菜、牛肉等食物中含有丰富的NMN，在体内，NMN也能够自发转化为NAD+[5]。补充NMN是有效提高体内NAD+水平的方法。既往研究已经证实，短期服用NMN对肥胖并发症有显著的治疗效果[6]。此外，NMN通过防止缺血引起的NAD+减少来保护心脏免受缺血再灌注损伤[7]。本研究通过构建老年小鼠模型，同时在饮用水中加入NMN，为期12个月，着重评估心脏功能的变化，并探索潜在的机制，以期将NMN作为一种解决年龄相关心功能缺陷的候选药物。

材料与方法

1.主要试剂与仪器：NMN(N3501)和OxyblotTMprotein oxidation试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司。NAD+检测试剂盒，BCA蛋白浓度检测试剂盒，MDA、SOD和ATP检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(DP705)购自天根生化科技(北京)有限公司。Fast SYBR Green Master Mix试剂盒购自北京博迈德基因技术有限公司。小鼠代谢笼购自苏州市冯氏实验动物设备有限公司。血糖仪和血糖试纸购自美国罗氏公司。Vevo®3100超声成像平台购自日本FUJIFILM公司。RT- PCR仪购自美国Biorad公司。

2.动物分组和模型建立：本研究符合《美国NIH实验室动物使用指南》规定，选用30只3月龄雄性C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于21～22℃恒温的标准清洁级环境，每隔12h光暗循环，自由饮食饮水，饲养至4月龄。采用随机分组对照的方法将小鼠分为：年轻组(n=10)小鼠即无其他处理的4月龄小鼠；老年组(n=10)即继续饲养至12～16月龄的老年小鼠；实验组(n=10)小鼠处理参照文献[8～10]饲养于代谢笼中，记录24h饮水瓶重量的变化确定每只小鼠每日饮水量7～10ml，按照每日8ml饮水量，水中添加NMN以保证小鼠每天获取NMN约300mg/kg，饲养至12～16月龄。由于NMN水溶液在室温下7天内保持稳定，3天更换一次饮水。老年组和实验组小鼠在整个饲养过程中每周同一时间测量体质量。

3.口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance test，OGTT)：测定年轻组小鼠4月龄，老年组和实验组小鼠16月龄的葡萄糖耐量。实验前1天禁食10h，尾静脉测量空腹血糖，之后腹腔注射2g/kg D-葡萄糖，分别在注射后30、60、90min测量血糖，并计算曲线下面积。

4.心脏超声检测：超声观察小鼠心脏运动。1%～2%异氟醚麻醉诱导后，仰卧位固定于恒温板上，胸前区备皮，稳定小鼠心率在500次/分左右，设置超声探头的探测深度为15mm。取胸骨旁左心室短轴切面，记录并分析M模式下小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction reflecting，LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。胸骨左下侧找到心脏四腔切面，记录并分析B模式下二尖瓣血流速度得到心室舒张早期和舒张晚期血流速度之比。

5.NAD+含量检测：具体参照试剂盒说明。称取20mg心肌组织，剪碎后加入NAD+/NADH提取液冰上进行匀浆。随后12000×g，4℃离10min，取上清作为待测样品备用。按照相应的试剂盒说明进行操作。算出NAD总量减去NADH含量即为NAD+含量，BCA法校正蛋白浓度得到NAD+含量。

6.丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及ATP含量检测：分别称取20mg心肌组织，充分剪碎后10000×g离心10min，留取上清按照相应的试剂盒说明进行操作。上清液蛋白浓度使用BCA法定量校正后得到MDA含量、SOD活性和ATP含量。

7.蛋白过氧化水平检测：提取10mg小鼠心肌总蛋白，定量后取20μg蛋白按照OxyblotTMprotein oxidation试剂盒说明制备样品，SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，5%白蛋白在室温下封闭1h，使用配套的抗体对DNP残基显影反映蛋白羰基化程度。用Image J测得总蛋白羰基化灰度值和内参蛋白GAPDH灰度值之比作为蛋白过氧化的相对表达值。

8.组织基因组DNA提取：取20mg心肌组织，尽量剪碎后加入300μl组织消化液GHA和20μl ProteinaseK后充分匀浆研磨组织。按照DNA试剂盒说明提取组织基因组DNA。

9.荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)：使用单拷贝基因烟酰胺腺嘌呤脱氧核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)脱氢酶亚单位1(NADH dehydrogenase subunit1，ND1)和GAPDH基因分别代表线粒体基因组和细胞核基因组。用Primer Premier 5.0软件设计引物，送北京擎科生物科技有限公司合成，序列参照表1。PCR总反应体系为8μl：2×SYBR Green master mix 4μl(200μmol/L)，10μmol/L上下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，ddH2O补足体积。反应参数为95℃ 10min；循环40次：95℃ 15s，60℃ 1min。融解曲线：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。结果以2-ΔΔCt计算。

表1 荧光定量PCR引物信息

结 果

1.NMN长期补充改善小鼠衰老相关表型：从4月龄开始，于饮水中添加NMN [300mg/(kg·d)]喂养小鼠至16月龄(图1中A、B)。相比常规喂养的老年组小鼠，实验组小鼠体质量增速减慢，16月龄时体质量较轻(P<0.01，P<0.01，图1中C～E)；OGTT提示，相比4月龄的年轻组小鼠，老年组小鼠葡萄糖耐受能力下降，而添加NMN的老年组小鼠葡萄糖耐量改善(P<0.05，P<0.01，图1中F、G)。这些结果提示，长期使用NMN可以改善小鼠衰老进程中的肥胖和糖耐量受损。

图1 喂养4月龄小鼠至16月龄构造老年模型A.小鼠模型构建示意图；B.实验组小鼠喂养示意图；C.小鼠典型的形态示意图；D.小鼠体质量增量曲线；E.小鼠体质量随时间变化曲线；F.口服葡萄糖耐量实验；G.血糖随时间变化的曲线下面积；*P<0.01，**P<0.001

2.NMN长期补充升高老年小鼠心脏NAD+水平并改善心功能：检测各组小鼠心脏NAD+含量发现，相比4月龄小鼠，16月龄的老年小鼠心脏NAD+含量明显降低，而NMN可以在一定程度上恢复老年小鼠心脏的NAD+水平(P<0.001，P<0.01，图2A)。此外，心脏超声发现，相比年轻小鼠，老年小鼠E/A比、LVEF、LVFS均下降(P值分别为<0.001、<0.001、<0.01，图2中B～E)，而NMN处理可以显著改善上述指标。以上结果说明，长期补充NMN增加老年小鼠心脏NAD+的同时缓解了衰老过程中心脏收缩和舒张功能的下降。

图2 3组小鼠心脏NAD+水平及心功能检测A.心脏NAD+水平；B.代表性心脏超声；C.心室舒张早期与舒张晚期血流速度之比；D.左心室射血分数；E.左心室短轴缩短率；*P<0.01，**P<0.001

3.NMN减轻老年心脏氧化应激，恢复线粒体质量：相比年轻小鼠，老年小鼠心肌MDA含量明显增高(P<0.01)，SOD活性下降(P<0.001)，且羰基化蛋白水平上升(P<0.01)，而补充了NMN的老年小鼠上述指标则得到改善(P值分别为<0.05、<0.01、<0.05，图3中A～D)。检测心肌ATP含量及mtDNA拷贝数目发现，老年小鼠的心肌ATP产生和mtDNA数目均减少(P<0.001，P<0.001，图3中E、F)，说明老年小鼠线粒体质量受损，而实验组小鼠心肌ATP含量和mtDNA都有一定恢复。这些结果提示NMN可以减轻衰老过程中小鼠心脏的氧化应激和线粒体损伤。

图3 3组小鼠心脏氧化应激指标及线粒体功能检测A.心脏MDA含量；B.心脏SOD活性；C.代表性羰基化蛋白修饰免疫印迹；D.羰基化蛋白相对水平；E.心脏ATP含量；F.心脏mtDNA相对表达量；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

讨 论

衰老过程中，NAD+水平会随着年龄的增长而降低，NMN作为细胞内NAD+合成的关键中间体引起了相关研究人员的注意。有研究报道，短期服用NMN可以减轻高脂饮食诱导的小鼠肥胖相关代谢紊乱[6,11]。也有研究发现NMN对无论是低血糖后葡萄糖再灌注大鼠或是睡眠剥夺小鼠的认知与记忆功能都有保护作用[12，13]。不仅如此，NMN还可以改善经历缺血再灌注损伤及主动脉缩窄的小鼠心功能[7,14,15]。但针对不同疾病模型，NMN的用法、用量有所差异。本研究参考文献[8～10]，于饮水中添加NMN [300mg/(kg·d)]喂养12个月，证实长期服用NMN能够缓解小鼠年龄增长所致的代谢相关生理衰退，如体质量增加和葡萄糖耐量受损。并且发现这一用法、用量对小鼠是可以耐受的，未观察到明显的不良反应。鉴于衰老过程中心功能减退及其对老年人群寿命和生活质量的重要性，本研究考虑长期服用NMN可以作为NAD+补剂进行抗衰老干预，尤其对于心脏是有益的。

随着年龄的增长，NAD+在小鼠和人体的多个器官或组织中的利用率都会下降，包括骨骼肌、脂肪、脑和心脏[16,17]。本研究观察到老年小鼠心脏NAD+含量明显低于年轻小鼠，且长期服用NMN的小鼠心脏NAD+含量有所回升，与既往研究一致[10]。心脏超声发现，无论是反映心室舒张功能的E/A比还是反映收缩功能的LVEF和LVFS，NMN补充均可以缓解老年小鼠这些参数的恶化。在细胞中，NAD+是许多生化反应的辅酶，广泛参与包括代谢、炎症、应激和损伤反应，同时也会不断地被消耗，如NAD+依赖的去乙酰化酶Sirtuins家族，DNA修复酶PARP等[4]。在心脏中，由于线粒体含量丰富，NAD+作为呼吸链上重要的辅助因子，对整个电子传递链的稳定影响巨大，于是本研究考虑NMN维持了衰老过程中心肌线粒体的稳态而保护了心功能。

衰老过程中，线粒体功能衰退，DNA断裂破坏等因素均会造成氧化应激增强，而线粒体对活性氧水平极为敏感[17]。检测膜脂质过氧化终产物MDA含量、体内主要抗氧化酶SOD活性及蛋白羰基化水平(蛋白质氧化损伤的一种)，老年小鼠心脏MDA含量增多而SOD活性降低，且羰基化的蛋白增多，但NMN补充的小鼠上述指标改善[18,19]。线粒体功能障碍也是衰老的一个标志，本研究发现NMN明显缓解了衰老过程中心肌ATP含量的下降。此外，尽管mtDNA拷贝数目在衰老过程中不可避免地减少，但NMN对这种趋势也有一定的抑制作用[20]。

综上所述，本研究发现长期补充NMN可以减少小鼠衰老表型及伴随的心功能损害，可能原因是减轻氧化应激而维持了线粒体功能。本研究亦有不足，NMN对衰老小鼠其他组织和器官的作用有待于进一步观察。此外，不同浓度下NMN的广泛效应及安全性还需进一步验证以便能应用于临床。