基于NLRP3/IL-1β、IL-18通路探讨CARDS Tx在儿童重症肺炎支原体肺炎中的作用

曹囡囡 黄 莉 焦琼杰 丁 霞 燕江雪 倪 倩

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是儿童社区获得性肺炎的最常见病原体之一，具有时段性爆发流行的特点。肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)患儿多数预后良好，但重症肺炎支原体肺炎(severe mycoplasma pneumoniae pneumonia，SMPP)患儿症状重、病程迁延，更易累及肺外多系统，如皮肤、神经系统、血液系统、消化系统等，若未及时干预，病情严重者可能合并多脏器衰竭而危及生命，预后易遗留肺部结构或功能后遗症，影响患儿生活质量[1,2]。

社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(community-acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS Tx)是由MP产生的一种外毒素，与MP的致病力有关[3]。Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)属细胞内模式识别受体，激活后介导经典途径的细胞焦亡发生，诱导极具促炎活性的白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-18大量产生，协同细胞焦亡后溢出的胞内容物引发强烈的炎症级联反应。CARDS Tx可能通过活化NLRP3参与SMPP的发生及进展[4]。

本研究通过观察CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18在SMPP和MPP患儿的血清及SMPP患儿的患侧及对侧支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的变化，探讨CARDS Tx和NLRP3/IL-1β、IL-18通路在儿童SMPP发生及进展过程中的致病作用，并评价CARDS Tx、NLRP3、IL-1β和IL-18对SMPP的预测价值。

对象与方法

1.研究对象：选取2020年10月～2021年9月兰州大学第二医院收治的MPP患儿为研究对象，根据疾病的严重程度将其分为MPP组和SMPP组。纳入标准：①0～14岁儿童；②符合MPP或SMPP诊断标准(参照《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》[5])；③病程在14天以内；④获得患儿家属知情同意。排除标准：①合并病毒、细菌等其他病原体感染；②合并支气管哮喘、慢性肺疾病、严重基础疾病等；③1个月内使用过糖皮质激素、免疫调节剂、免疫抑制剂等药物。本研究通过兰州大学第二医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：2020A-208)。MPP组中采集到静脉血标本共44例，未采集BALF标本。SMPP组中采集到静脉血标本共35例；采集到BALF标本共26例，此26例患儿在符合SMPP诊断标准的同时，影像学检查表现为单侧肺受累，收集其患侧(具有上述影像学表现侧)和对侧BALF标本，分别命名为患侧组和对侧组。选择同期至兰州大学第二医院体检、0～14岁并且近1个月内无感染史的26例健康儿童为对照组，采集其静脉血标本。采集到静脉血标本儿童的MPP组、SMPP组与对照组间年龄、性别资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 一般资料比较

2.标本采集：清晨空腹时(或至少禁食8h)、入院后但未予治疗前，用红色非抗凝管采集静脉血3ml，于4℃环境下以3000r/min的速度离心15min后，留取上清，置于-80℃冰箱保存，以备检测。入院后，在行电子支气管镜检查并支气管肺泡灌洗术的同时，分别采集患儿的患侧与对侧BALF，患侧选择病变段，对侧选择右肺中叶或左上叶舌段，总回收率≥30%、红细胞<20%，且无大气道分泌物混入为合格标本。将新鲜BALF收集至无菌塑料离心管中，反复冻融，于4℃环境下以3000r/min的速度离心15min后，留取上清，置于-80℃冰箱保存，以备检测。

3.实验方法：使用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清和BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β和IL-18的水平。ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。酶标仪为Mulltiskan FC型酶标仪，购自赛默飞世尔仪器有限公司。

结 果

1.CARDS Tx与NLRP3的相关性分析：将血清中CARDS Tx与NLRP3水平进行Pearson相关性分析，CARDS Tx与NLRP3之间呈显著正相关(r=0.757，P<0.001，图1A)；将BALF中CARDS Tx与NLRP3水平进行Pearson相关性分析，CARDS Tx与NLRP3之间亦呈显著正相关(r=0.465，P<0.01，图1B)。

图1 血清、BALF中CARDS Tx与NLRP3的相关性A.血清中CARDS Tx水平与NLRP3水平的相关性；B.BALF中CARDS Tx水平与NLRP3水平的相关性

2.BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比较：SMPP组患儿中，患侧BALF中的CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平显著高于对侧，差异均有统计学意义(P<0.001，表2)。

表2 患侧与对侧BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比较

3.血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比较：MPP组、SMPP组、对照组患儿血清中CARDS Tx水平相互比较，SMPP组(35.97pg/ml)>MPP组(29.38pg/ml)>对照组(18.11pg/ml)，差异有统计学意义(H=58.996，P<0.001)，详见图2A；血清中NLRP3水平相互比较，SMPP组(700.25±119.98pg/ml)>MPP组(543.18±109.55pg/ml)>对照组(462.20±64.86pg/ml)，差异有统计学意义(F=42.446，P<0.001)，详见图2B；血清中IL-1β水平相互比较，SMPP组(62.61pg/ml)>MPP组(47.58pg/ml)>对照组(35.57pg/ml)，差异有统计学意义(H=65.592，P<0.001)，详见图2C；血清中IL-18水平相互比较，SMPP组(264.18pg/ml)>MPP组(207.67pg/ml)>对照组(169.14pg/ml)，差异有统计学意义(H=58.601，P<0.001)，详见图2D。

图2 MPP组、SMPP组、对照组血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平比较A.MPP组、SMPP组、对照组血清中CARDS Tx水平比较；B.MPP组、SMPP组、对照组血清中NLRP3水平比较；C.MPP组、SMPP组、对照组血清中IL-1β水平比较；D.MPP组、SMPP组、对照组血清中IL-18水平比较

4.血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平对SMPP的预测价值：将非SMPP组儿童与SMPP组患儿血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18的水平进行ROC分析，各指标的曲线下面积(area under the curve，AUC)均大于0.7，差异有统计学意义(P<0.001，表3，图3)。

图3 血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平预测SMPP的ROC曲线

表3 血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平预测SMPP的ROC分析

讨 论

CARDS Tx是由MP产生的一种外毒素，具有致细胞空泡化作用和腺苷二磷酸核糖基转移酶(ADPribosyltransferase，ART)活性[6]。CARDS Tx内化进入靶细胞后发挥致病作用，其致细胞空泡化作用能够直接损伤呼吸道屏障，ART活性是一种可逆的蛋白翻译后的共价修饰作用，可以使分子构象发生改变，从而改变靶向分子的生物活性[7]。NLRP3受到病原相关分子模式或危险相关分子模式的刺激后首先上调NLRP3与IL-1β前体、IL-18前体的表达，物质准备完成后即募集凋亡相关斑点样蛋白与半胱天冬氨酸蛋白酶-1前体启动NLRP3炎性小体的组装，介导下游细胞焦亡发生[8]。CARDS Tx可能通过对NLRP3蛋白的翻译后修饰作用激活NLRP3，活化的NLRP3触发细胞焦亡后致机体产生大量的IL-1β和IL-18[9]。目前，国内外未见CARDS Tx/NLRP3/IL-1β、IL-18通路与SMPP相关的临床研究报道。

本研究发现，CARDS Tx与NLRP3在血清和BALF样本中均呈显著正相关，与Xia等[10]使用重组CARDS Tx处理THP-1细胞后NLRP3、IL-1β基因表达增加的研究结果一致，表明MP入侵人体后释放的CARDS Tx可以激活NLRP3，具体的激活机制仍需开展深入研究。

Li等[11]比较MPP患儿与肺部无炎症改变的支气管异物患儿的BALF中CARDS Tx水平，发现MPP患儿BALF中CARDS Tx水平明显增高。国内亦有研究表明，MP感染后具有喘息症状患儿的血清CARDS Tx水平高于无喘息症状患儿，表明CARDS Tx参与气道的局部损害[12]。本研究比较了SMPP患儿患侧和对侧BALF中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平，发现上述4个因子的表达患侧均显著高于对侧，进一步说明CARDS Tx是诱发SMPP患儿局部肺损伤的重要因素，而NLRP3/IL-1β、IL-18通路是CARDS Tx介导SMPP患儿局部肺损伤的重要致病机制。

本研究检测了MPP组、SMPP组、对照组血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18的水平，4个因子的比较结果均为SMPP组>MPP组>对照组，说明MP释放的CARDS Tx可穿过呼吸道上皮屏障进入血液循环，并激活NLRP3/IL-1β、IL-18炎性通路，介导MPP的发生。CARDS Tx在SMPP患儿的血液循环中表达水平显著高于MPP患儿，表明大量CARDS Tx被释放入血后过度激活NLRP3/IL-1β、IL-18通路对SMPP的发生、发展具有重要致病意义。另外，笔者团队推测血液循环中高水平的CARDS Tx很有可能是SMPP肺外组织并发症的发病基础，或许亦通过激活NLRP3/IL-1β、IL-18通路致SMPP患儿肺外组织炎性损伤，此观点有待于进一步研究证实。

本研究中ROC分析表明，血清中CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平是预测SMPP的有效指标，其中IL-1β的AUC值最高，其次为IL-18> NLRP3>CARDS Tx。CARDS Tx的敏感度稍低，但具有较高的特异性，其余3项指标的敏感度及特异性均较高，其中IL-1β和IL-18在临床中是常用指标，多数医院均可检测，具有良好的实用性。若动态监测血清中此4项指标的变化情况，可能对于判断SMPP的治疗效果具有一定价值，值得进一步论证。

综上所述，CARDS Tx不仅可激活NLRP3/IL-1β、IL-18通路介导SMPP的发生，亦是参与SMPP患儿局部肺损伤的重要机制。另外，CARDS Tx很有可能通过血行途径介导SMPP患儿的肺外组织损伤，有待进一步深入探究。本研究表明，血清CARDS Tx、NLRP3、IL-1β、IL-18水平对于预测SMPP具有重要意义，动态观察其变化趋势或许对于评估SMPP的治疗效果亦具有重要价值。本研究的不足之处是样本量较小，今后仍需扩大样本量继续研究，以得到更多证据予以进一步证实。