白酒中四甲基吡嗪形成机制及相关应用的研究进展

孙玉婷，郑晓卫，，叶 力，陈玉红，杨 鑫，刘沛通，丁子元

(1.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416099)

中国白酒历史悠久，以粮谷类为主要原料，以大曲、小曲或者麸曲为糖化发酵剂，采用固态、半固态或者液态的发酵方式，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、老陈、勾调等过程制成[1]。中国白酒由于其生产所在的自然环境差异、酿造原料差异、糖化发酵剂差异、生产工艺差异和馏酒差异，风格各具特色。

随着“健康中国”战略的制定与实施，消费者对于白酒健康层面的需求也愈加明显。食品安全与饮食健康成为热议话题[2]，健康饮酒被提升至新的高度。据统计，2015—2019年白酒消费趋势向名优产品转变，白酒产业正在向高质量发展稳步推进，研究内容也向白酒健康价值等方向倾斜。

已知白酒中的功能因子包含酸类、醇类、酚类、酯类、醛酮类、活性肽、氨基酸、多糖和吡嗪类等，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降脂、降血压、镇痛、抑菌、降血糖，预防心脑血管疾病、精神系统疾病等功效[3]，如亚麻酸、γ-氨基丁酸、洛伐他汀等成分早已在行业开展研究。

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪[4]，易溶于醇，微溶于水，近年来受到行业内广泛关注。其对白酒酱香风味的形成有重要贡献，同时也是行业公认的“健康因子”，具有扩张血管、轻度降压、防止血小板凝集与血栓形成、抑制纤维细胞增生、调节脂质代谢、提升免疫水平、利尿、护肝、体外抗炎等诸多功效[5-6]。本文综述了TTMP 在白酒中的研究进展，旨在为后续学者进一步研究提供参考。

1 TTMP在白酒中的研究进展

早在20 世纪80 年代，在白酒风味物质解析时发现了TTMP 的存在，2005 年，庄名扬提出通过美拉德反应生成吡嗪等杂环化合物有助于白酒风味的形成[7]，2006 年吴建峰提出TTMP 是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在，引起行业关注[5-6]，2012 年徐岩团队[8]依托“中国白酒169 计划”分析检测到茅台酒中有重要风味贡献度的物质中TTMP 等吡嗪类化合物有较高浓度，为白酒“健康因子”概念的引入奠定基础。

随着人们对健康关注度的提高和日常检验分析技术的提升，近年来TTMP 在白酒领域的研究热度逐渐升温，热点集中于探究白酒发酵过程中TTMP 的生成方式和重要积累环节，高产TTMP 功能菌株的分离、筛选及强化应用，利用多种检测手段对白酒生产过程与成品酒中的TTMP 进行定性与定量分析等[9]。

1.1 白酒酿造过程中TTMP的生成和积累

1.1.1 TTMP的生成方式

早期学者对于TTMP 在白酒发酵过程中的生成方式普遍认为有两种路径：葡萄糖和氨基酸在高温作用下通过美拉德反应生成；微生物引发糖降解产生丙酮酸，两分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脱羧产生乙偶姻，发酵体系中的乙偶姻和氨基酸在相关酶的催化作用下生成TTMP[8，10]。随着研究的深入，通过第二种路径生成TTMP的结论被不断证实。

吴建峰[6]于2013 年发现并证明在固态发酵条件下，功能菌株枯草芽孢杆菌S12 代谢产生3-羟基丁酮（又名：乙偶姻），同时S12 分泌蛋白酶将蛋白质降解为氨基酸，氨基酸脱氢得到氨，3-羟基丁酮和氨通过缩合作用合成TTMP，且高温有利于此缩合反应的发生。

张温清[9]基于功能菌株强化接种与TTMP 产生情况，证实糟醅中TTMP 含量与温度和功能菌株丰度呈正相关，酿酒过程中TTMP 是由酿造微生物通过生物途径代谢产生，并且高温对其形成有促进作用，进一步证实固态发酵条件下的TTMP 生成方式并非传统认为的美拉德反应，而是生物反应。

侯孝元[11]总结了前人对于TTMP 的合成路径研究经验，总结出提高微生物发酵生成TTMP 的两种方法：一是获得优良菌株，提高前体乙偶姻的积累量；二是向发酵液中添加铵盐提高乙偶姻转化率和四甲基吡嗪的产率。

综上所述，TTMP 的生物代谢途径为通过性能优良菌株获得TTMP的前体物质3-羟基丁酮，3-羟基丁酮与氨在高温作用下发生缩合反应生成TTMP，氨的来源包括外部环境添加、底物中蛋白质降解脱氢等。

1.1.2 TTMP的重要产生环节

白酒酿造过程涉及制曲、发酵、蒸馏等多个环节，不同企业在发展过程中摸索形成了自身独具特色的酿造工艺，加之地域差异导致的菌群差异，从而形成国内十二大白酒香型。基于目前的研究报道，酱香型和芝麻香型白酒中吡嗪类物质的含量相较于其他香型白酒是最高的，与其生产工艺密切相关[12]。酱香型白酒和芝麻香型白酒酿造工艺都具有高氮原料、高温制曲、高温堆积、高温发酵以及高温馏酒的特点。这与上述吴建峰与张温清提出的高温对TTMP 形成有促进作用的结论相印证。同时二位学者以芝麻香型白酒酒曲、酒醅和基酒等为研究对象，对TTMP 的积累环节进一步验证，得到多粮曲高于小麦纯粮曲，高温曲（顶温近67 ℃）高于中温曲（顶温50～55 ℃），细菌曲高于真菌曲的结论，吡嗪类物质在堆积后含量增加，高温发酵和高温蒸馏也有利于TTMP 形成，原酒储存中不产生TTMP[6，9]。

图1 基于酶与热力学耦连的TTMP合成路径图

相较小麦纯粮曲，多粮曲中增加了高含蛋白的豌豆、大麦等原料，为TTMP 的形成提供了更多必要的氮类前体物质。高产TTMP 前体物质3-羟基丁酮的优良菌株主要为细菌而非真菌，高温是缩合反应生成TTMP 的必要条件。TTMP 在酿酒过程中的重要产生环节包括高温制曲、高温堆积、高温发酵等。

1.2 TTMP功能菌株分离、筛选及强化应用

1.2.1 功能菌株的分离与筛选

与上述TTMP 的主要产生环节相关联，野生型功能菌株的主要来源为高温大曲和高温堆积料等，已报道的功能菌株主要集中在芽孢杆菌属（Bacillus），包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）等，也与上述细菌曲高于真菌曲的实验结论相印证[6，9]。功能菌株的分离多依赖传统培养方式，以基于感官评价的产酱香能力[13]或基于生化反应（V-P 实验）的产乙偶姻（TTMP 前体物质）能力作为筛选指标[14]，也有学者将产蛋白酶能力与产乙偶姻能力作为双筛指标[9]，以获得功能菌株。V-P 实验基本原理为乙偶姻在强碱环境下，氧化为双乙酰，双乙酰与胍基反应生成红色化合物，甲萘酚的存在可以促进并加速红色物质生成，于500～600 nm 范围内有光吸收，吸光度在一定范围内与乙偶姻浓度呈正相关，基于此原理，学者们开发了平板筛选、高通量筛选等方法。

野生型菌株生产TTMP 产量低的问题普遍存在，学者们采用诱变育种、基因工程等手段对产TTMP菌株进行改造与调控，以期获得高产菌株。许平等[15]采用亚甲基胍诱变方式对出发菌株做诱变筛选，以期提高诱变菌株产TTMP 能力；郭维伟[16]对从景芝芝麻香白酒高温大曲中分离的野生地衣芽孢杆菌进行等离子诱变，筛选获得高产突变株，发酵液产量达到20.24 g/L，比原始菌株提高了72.67%，遗传性状稳定；黄晓润[17]对枯草芽孢杆菌产酱香相关基因进行筛选与功能研究，锁定得出3个产酱香候选基因cdo A（半胱氨酸双加氧酶）、pan E（酮泛解酸还原酶）、lsp A（脂蛋白信号肽酶Ⅱ），并证实3 个基因最终作用于丙酮酸途径，从而影响四甲基吡嗪合成；Wu 等[18]通过敲除枯草芽孢杆菌BS2 中的bdh A（2,3-丁二醇脱氢酶）基因，增加乙偶姻的积累从而增加发酵终产物中的TTMP产量，为从基因层面实现产物表达调控提出了研究思路。

图2 V-P实验反应

1.2.2 功能菌株的强化应用

白酒酿造过程中功能菌株的强化应用场景多发生于TTMP 的主要产生环节，包括制曲、堆积和发酵等。

1.2.2.1 强化制曲

强化制曲分为强化麸曲与强化大曲两个工艺方向，强化麸曲的研究与应用最为多见。强化麸曲的应用场景之一是在传统酿造工艺的基础上，引入强化麸曲或改良麸曲以实现酒体风味的改变与提升，如张温清[9]对芝麻香麸曲原料配比、酸碱度、含水量和接种量等因素进行工艺优化，获得的功能麸曲中TTMP 含量达607.58 mg/kg，以丢糟作为功能麸曲原料之一进一步优化制备工艺，TTMP 产量达1.28×103mg/kg，为目前报道的最高水平；葛向阳等[19]将接有功能菌株的大曲应用到酿造环节以探索浓香型白酒高产TTMP 的酿造工艺，结果表明，60%的功能曲与40%的大曲结合可以使浓香型原酒TTMP 含量提高到3～6 mg/L，是原始工艺的5～20 倍；李晓霞[20]从汾酒大曲中分离获得高产TTMP菌株，制备成固态菌剂后，在不干扰正常的酿酒生产下，以1 %添加量同大曲一并加至酒醅中，进行入缸发酵，结果表明TTMP 含量增加到5.3 μg/mL，为对照组的3倍。

1.2.2.2 强化发酵

强化发酵包括强化堆积发酵与强化入池发酵两个方向。王西等[21]将从高温大曲中筛选得到的枯草芽孢杆菌分别接种到酱香型二次酒高温堆积前和入池前的糟醅中，模拟酱香型白酒生产完成堆积与入池发酵过程，“堆积组”发酵后的TTMP 含量是“空白组”的3.08 倍，“入池组”发酵后的TTMP 含量是“空白组”的2倍。王晓丹等[22]将从高温大曲中分离得到的地衣芽孢杆菌添加到粹沙酒窖池中层的糟醅中，发酵后TTMP含量是对照组的3.03倍。

1.2.2.3 多环节强化工艺结合

除上述单一强化手段外，学者们也将功能菌株强化应用于白酒酿造的多个环节中，或在原有工艺基础上改良多个环节。艾金钟等[23]在红星二锅头原有工艺基础上，增加高温堆积环节，将蛋白酶活性较高的芽孢杆菌制备为功能麸曲，联合高温大曲共同用于堆积发酵，在原酒风格基本不变的情况下，TTMP 含量由原工艺的0.03 mg/L 提高至约10 mg/L；马美荣等[24]从北京红星（清香型）大曲中分离获得高产TTMP 芽孢杆菌用于麸曲制作，结合高温堆积发酵过程用于清香型白酒生产，原酒风格整体不变，TTMP 含量由传统工艺的0.11 mg/L 提升至10 mg/L 以上；卢君[25]将功能菌株制备为固体菌剂，分别通过在入池发酵前进行强化接种、将菌剂加入尾酒中用于酒糟串蒸以及将上述两种方法相结合的方式进行工艺优化，酱香型白酒基酒中TTMP 的含量分别提高160.71%、85.75%和202.75%。

尽管功能菌株的强化应用研究如火如荼，但大家的关注点普遍在于基酒中四甲基吡嗪含量的变化，对于强化应用后整体酒质风味、风格的改变，发酵过程中强化菌株对于原始菌群的扰动情况并未做深入分析，行业也暂无实际强化应用的案例，可见对于功能菌株的应用仍需建立在对发酵机理研究更为透彻的基础之上。

2 TTMP的检测

2016 年国家发布了GB 1886.295—2016《食品添加剂2,3,5,6-四甲基吡嗪》，该方法适用于由2,3-丁二胺和丁二酮，或者由乙偶姻和铵盐制备而得的食品添加剂TTMP，此国标方法的检测对象为高纯度TTMP。白酒在酿造过程中发酵底物复杂，状态多样，代谢化合物种类繁多，TTMP 作为白酒中的微量组分，对检测方法的适用性和准确度提出挑战。目前，白酒中TTMP 的分析步骤涉及萃取和检测过程。

2.1 萃取方法

白酒过程样品及成品酒样中TTMP 的常见萃取方法包括液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、液液微萃取（LLME）、固相微萃取（SPME）和顶空固相微萃取（HS-SPME）等[26]，不同提取方法有各自的优缺点。

在此基础上学者们也对提取方法做了进一步优化，如孙啸涛等[26]建立了涡旋辅助液液微萃取技术，使待测化合物在样品溶液及萃取剂之间1 min达到萃取平衡，具有高效、快速和低溶剂消耗的特点，实现了快速萃取技术的开发。

2.2 检测方法

早期学者多使用液相色谱法（LC）[35-36]和气相色谱法（GC）[34，37]完成白酒过程样品及成品样品中TTMP 的检测，上述检测方法操作简单，精密度较高，对白酒厂的仪器设备条件要求不高，便于推广。随着检测技术的提升与各种高端质谱的引进，气质联用技术（GC-MS）与液质联用技术（LC-MS）在白酒行业兴起，质谱联用技术极大提高了检测准确度，降低了目标物检出的限量值。司冠儒等[38]基于芝麻香型白酒样品对气相色谱法、液相色谱法和液相色谱质谱联用法的重复性和精确度进行评估，发现上述技术均可以满足白酒厂日常检测分析的要求。基于日常检测经验，针对大曲、糟醅等TTMP 含量较低的复杂基质，液相色谱质谱联用法检出限更低，灵敏度更高，为后续学者开展检测工作提供参考。

黄杰等[39]建立了白酒中TTMP 的气相色谱-三重四级杆质谱（GC-QQQ）测定法，该法样品预处理简单，分离度高，测定低限0.2 mg/L，为定量测定白酒中TTMP 提供了一种有益探索；Zhu 等[40]使用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）技术对茅台中的重要风味物质进行定性与定量识别，有效识别出含氮类物质19 种，包括TTMP；王柏文等[28]应用气相色谱-质谱（GC-MS）与气相色谱-氮磷检测器（GC-NPD）技术对国井芝麻香型白酒中含氮化合物进行分析，含氮化合物专用检测器相较传统质谱检测器灵敏度更高，提高了白酒中含氮化合物检测的精度。

表1 TTMP的常见萃取方法

3 结语

随着国民生活水平的显著提高，我国已经进入了消费者对美酒追求的时代，但白酒行业整体产能过剩，优质酒产能不足，成为优质白酒在消费市场供应的关键矛盾点，因此白酒产品势必要向“风味与品质”双导向转变。

白酒中TTMP 的相关研究已经持续数十年，随着健康因子概念的提出，更是成为行业研究热点。但目前仍存在一些问题有待探讨，如高产TTMP 菌株的强化接种操作对整个白酒酿造体系中繁杂的菌系、酶系和物系存在更多积极或消极的影响还未知，功能菌剂的实际应用仍属于起步阶段，TTMP在白酒领域的检测方法仍没有统一的标准等。

白酒中微量成分多种多样，健康因子种类众多，除文中提到的TTMP，还包括萜烯类、多元醇和生物活性肽等[3]，对于白酒中功能成分的研究将有助于消费者正确认识白酒，树立白酒正确的消费观和价值观，真正实现“少喝酒，喝好酒”，“理性饮酒，健康消费”。