双水相-GC-MS/MS测定酱香型白酒酿造过程挥发性酚类物质变化规律的研究

毕荣宇，卢 君，唐 平，山其木格，王 丽，王 凡，李长文

（1.贵州国台酒业集团股份有限公司，贵州仁怀 564501；2.天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410）

中国白酒酿造历史悠久，作为十二大香型白酒之一的酱香型白酒因其独特的风格越来越受到人们的喜爱，已融入到日常生活的各个领域[1-2]。酱香型白酒起源贵州，是以当地糯红高粱为原料，小麦制作的高温大曲作为糖化发酵剂，经蒸煮、发酵、蒸馏、贮存、勾兑等酿造工艺而制成的[3]。相关研究表明，小麦皮中含有0.5%的阿魏酸，在发酵过程中会生成4-甲基愈创木酚（4-Methylguaiacol，4-MG）、4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG）等酚类化合物。酚类化合物在酱香型白酒风味和口感上起着非常重要的作用[4-5]。相关研究认为，当4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-EG 的总量在酒中的浓度小于400 μg/L 时，会使酒产生辛香、烟气和革香韵的风味，当总质量浓度大于620 μg/L时，会使酒产生明显的酚类特征，产生腥异味，掩盖酒的香味[6-11]。因此对白酒中挥发性酚类化合物进行定性定量检测，监测其含量的变化，优化生产工艺，避免产生异杂味，就显得尤为重要。

目前，酒样中酚类化合物的前处理方法主要有直接进样[12]、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[13-14]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[15]、固相萃取（solid phase extraction，SPE）[8，16]、搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）[17]等。检测方法主要有气相色谱法（gas chromatography，GC）、气相色谱质谱法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[18]等联合上述前处理方法进行酚类化合物的分析研究。

对比不同酚类化合物的前处理方法，每种方法都有各自优点和不足[19]。本研究利用双水相萃取的前处理方式，以白酒中的乙醇作为萃取剂，加入无机盐进行分相，通过双水相萃取法直接提取酚类化合物，结合气相色谱质谱联用技术测定白酒中的酚类化合物。该方法操作条件温和、提取工艺简单、易于连续操作、效率高、无毒无害、成本低[20-23]，适用于白酒企业对酚类化合物的定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：酒样（JT、LT、GT、DT、XT、MT、ZT 系列酱香型白酒），市售；由GT 酒厂提供的一至七轮次酱香型白酒基酒。

试剂及耗材：无水磷酸氢二钾（分析纯），乙醇（色谱级），愈创木酚（Guaiacol，Gua；纯度98.0%），4-甲基愈创木酚（4-Methylguaiacol，4-MG；纯度＞98.0%），4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG；纯度99.0%），4-甲基苯酚（4-Methylphenol，4-MP；纯度≥99.7 %），4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP；纯度97.0%），苯酚（Phenol，Phe；纯度≥99.5%），4-乙烯基愈创木酚（4-Vinylguaiacol，4-VG；纯度≥98.0%）均购自上海阿拉丁（aladdin）公司。

仪器设备：TQ8030 气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪，配备AOC-20i 自动进样器，日本岛津公司；ME204T 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-250E 超声波发生器，昆山市超声仪器有限公司；Vortex-Genie2 涡旋混合器，美国Scientific Industries 公司；Gen Pure xCAD Plus 纯水机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器检测条件

色谱条件：色谱柱为Agilent DB-WAX 色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；程序升温为初始柱温100 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升温至200 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min；载气为高纯氦气(纯度＞99.999 %)，流量控制方式为线速度；压力145.2 kPa；总流量9.0 mL/min；流速1.0 mL/min；线速度26.3 cm/s；进样方式为不分流进样；进样量1 μL。

质谱条件：电离方式为电子电离源(elctron ionizotion，EI)；电离能量70 eV；传输线温度230 ℃；离子源温度230 ℃；监测方式为选择离子扫描(single ion monitoring，SIM)；四级杆温度150 ℃；溶剂延迟10 min。

1.2.2 标准溶液的制备

准确称取Gua，4-MG，4-EG，4-MP，4-EP，Phe，4-VG 各49.4 mg，48.4 mg，47.4 mg，49.9 mg，56.7 mg，52.8 mg，50.5 mg，用色谱级无水乙醇定容至25 mL。取7种多酚化合物标准溶液各0.5 mL至100 mL 容量瓶中，用色谱级无水乙醇定容，作为标准中间液。分别取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 中间液至10 mL 容量瓶中，再取0.2 mL 中间液至100 mL容量瓶中，定容，作为标准曲线点。

1.2.3 样品前处理

酒样混匀后放置磨口玻璃瓶内待用。准确量取酒样5.00 mL 于10 mL 具塞磨口离心管中，向离心管中加入无水磷酸氢二钾固体，直至饱和为止，静置分层。取上清液2.0 mL 于2 mL 离心管中，加入无水硫酸镁200 mg，涡旋1 min混匀，10000 r/min离心10 min，取上清液，供GC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 质谱定性与定量

取20 μg/mL的7种酚类化合物标准中间溶液，按照最佳色谱条件进行全扫描，得到7 种多酚化合物的总离子流色谱图，见图1；同时确定每种物质的保留时间、定性离子和定量离子，选择结果见表1。由图1 可知，7 种酚类化合物均实现了良好的分离，为准确定量分析奠定了基础。由表1 可知，选定1 个定量离子，4 个定性离子，采用选择离子扫描（SIM）模式进行数据的采集。

表1 7种酚类化合物保留时间、定性和定量离子

图1 7种酚类化合物总离子流色谱图

2.2 方法的线性范围，检出限与定量限

以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。7 种酚类化合物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限列于表2。由表2 可知，7 种酚类化合物在浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）≥0.999。利用0.02 μg/mL 的浓度水平为依据，3 倍信噪比计算检出限，10 倍信噪比计算定量限。

表2 7种多酚化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限与定量限

由表2 可以得出，Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG 的检出限分别为0.0030 μg/mL、0.0031 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0041 μg/mL、0.0011 μg/mL、0.0028 μg/mL，定量限分别为0.0101 μg/mL、0.0102 μg/mL、0.0075 μg/mL、0.0076 μg/mL、0.0137 μg/mL、0.0037 μg/mL、0.0093 μg/mL。本方法具有较低的检出限与定量限，灵敏度能够满足酱香型白酒中酚类化合物的检测需求。

2.3 回收率与精密度试验

准确移取5 mL 的酒样，分别按照低、中、高三个水平添加酚类化合物标准溶液，按照样品前处理方法进行处理和测定不同酚类化合物的含量，每个浓度平行测定6 次，计算不同酚类化合物的平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。

由表3 可知，7 种酚类物质的加标回收率在90.74%～120.16%之间，精密度在1.17%～7.64%之间，回收率良好，精密度均小于10 %，满足实验检测的要求。

表3 酚类物质加标回收率及精密度

2.4 酒样检测

2.4.1 酱香型白酒检测

相关研究表明，酚类物质能为白酒提供独特的焦酱味、奶香味、烟熏风味和窖泥味，是白酒风味组成不可缺少的一部分。但有些酚类化合物还会给酒体带来异嗅味，如苯酚具有药气味、烟臭味，4-甲基苯酚具有窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、动物臭，4-乙基苯酚呈动物臭、马厩臭[24]，徐岩等[25]的研究证明4-甲基苯酚是浓香型白酒产生窖泥臭味的来源。4-乙基愈创木酚具有烟熏和丁香气味，在浓度高时呈臭豆酱气味，浓度低时似酱香空杯留香气味[26-28]；愈创木酚具有水果香、焦酱香，杨玉波等[29]的研究表明，茅台酒中愈创木酚的质量浓度与“粮香”强度具有正相关性，对“粮香”有着十分重要的作用。利用实验所建立的分析方法，对不同品牌酱香型白酒中酚类化合物的含量进行测定，每个样品平行测定2次，计算平均值，检测结果见表4。

由表4 可知，所选不同品牌系列酱香型白酒中酚类化合物的含量存在差异。除JT4、JT5 未检出Gua，LT4 未检出Gua、4-EG、4-VG 及LT5 未检出4-EG、4-VG 外，其余酱香型白酒样品均检测出7 种酚类化合物。Gua 的浓度范围是0.0000～0.2020 μg/mL，含量最高的是MT3；4-MG 的浓度范围是0.0095～0.1006 μg/mL，含量最高的是JT2；Phe 的浓度范围是0.0447～0.1906 μg/mL，含量最高的是ZT3；4-EG 的浓度范围是0.0000～0.0742 μg/mL，含量最高的是MT3；4-MP 的浓度范围是0.0084～0.2426 μg/mL，含量最高的是GT5；4-EP 的浓度范围是0.0017～0.0541 μg/mL，含量最高的是MT2；4-VG 的浓度范围是0.0000～0.2043 μg/mL，含量最高的是GT5；酚类化合物总量的浓度范围是0.1375～0.9268 μg/mL，含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 总量的浓度范围是0.0072～0.1275 μg/mL，含量最高的是MT3，研究表明4-EP 和4-EG 的浓度在小于400 μg/L 或大于620 μg/L 时会对酒体造成不同的影响，小于400 μg/L 时，会使酒产生辛香、烟气和革香韵的气味，大于600 μg/L 时，会产生腥味，通过检测可知，所选酱香型白酒中4-EP 和4-EG 的总量均小于400 μg/L，不会对酒体造成影响。对比分析7 个品牌的5 款系列酱香型白酒酚类化合物总量的平均值发现，GT 系列酱香型白酒中的含量最高，浓度为0.6354 μg/mL，其次是MT系列，浓度是0.5561 μg/mL，最低的是LT系列白酒，浓度是0.2175 μg/mL。

表4 酱香型白酒中酚类化合物 (μg/mL)

酚类化合物作为白酒中的健康活性物质，为健康饮酒奠定了一定的物质基础。4-MG 和4-EG 可以抗氧化、有效的预防疾病、延缓衰老，促进人体健康，4-EG还可降低血糖活性[30-31]。愈创木酚在临床上可用于治疗慢性气管炎的多痰咳嗽。但是苯酚不仅是一种有害的物质，含量过高时还会造成酒体出现异味，所以在白酒的生产过程要控制苯酚的含量[32]。

2.4.2 不同轮次酱香型白酒基酒检测

酱香型白酒复杂的“12987”酿造工艺过程，即一年生产周期、两次投粮、九次蒸煮、八次发酵、七次取酒，造就了其独特的风格品质。由于不同季节环境、原料、大曲、微生物环境以及发酵过程酒醅性质的不断变化，导致七个轮次基酒具有明显不同的风格[33-34]。利用实验所建立的分析方法，对GT 提供的七个轮次的酱香型白酒基酒中酚类化合物的含量进行测定，每个样品平行测定5 次，计算平均值，检测结果见表5。

表5 不同轮次酱香型白酒基酒酚类化合物 (μg/mL)

由表5 可以看出，一轮次基酒中酚类化合物总量最高，为0.0373 μg/mL，发酵初期，原料中生成酚类物质的前体物质较多，导致一轮次基酒中酚类物质含量最高；最低是三轮次，为0.2101 μg/mL。一轮次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物质含量也显著要高于其他轮次基酒。四轮、五轮、六轮次酚类物质的质量浓度较为接近。了解不同轮次基酒中酚类物质的变化规律，有助于企业优化调控工艺，控制酒中酚类化合物含量。

3 结论

本研究采用双水相萃取结合气相色谱-质谱联用法建立了一种简单，快速，高效分析酱香型白酒中酚类化合物的方法。该方法可以快速测定7种酚类化合物，且分离效果良好，线性范围为0.0200～10.0000 μg/mL，相关系数（R2）均大于0.999，精密度在1.17 %～7.64 %，回收率为90.74 %～120.16 %，检出限为0.0011～0.0041 μg/mL，定量限为0.0037～0.0137 μg/mL。利用该方法测定不同品牌酱香型白酒及GT提供的一至七轮次的酱香型白酒基酒中酚类化合物含量，结果表明，除JT4、JT5 未检出Gua，LT4未检出Gua、4-EG、4-VG及LT5未检出4-EG、4-VG外，其余酱香型白酒样品均检测出7种酚类化合物。Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG含量最高的分别是MT3（0.2020 μg/mL）、JT2（0.1006 μg/mL）、ZT3（0.1906 μg/mL）、MT3（0.0742 μg/mL）、GT5（0.2426 μg/mL）、MT2（0.0541 μg/mL）、GT5（0.2043 μg/mL）。酚类化合物总量的浓度范围是0.1375～0.9268 μg/mL，含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 总量的浓度范围是0.0072～0.1275 μg/mL，含量最高的是MT3，研究表明4-EP 和4-EG 的浓度大于620 μg/L 时会对酒体造成不良的影响，通过检测可知，所选酱香型白酒中4-EP 和4-EG 的总量均小于400 μg/L，不会对酒体造成影响。对比分析系列酱香型白酒酚类化合物总量的平均值发现，GT 系列酱香型白酒中的含量最高，其次是MT 系列，最低的是LT 系列白酒。对轮次基酒的研究发现，一轮次基酒中酚类化合物总量最高，为0.0373 μg/mL；最低是三轮次，为0.2101 μg/mL。一轮次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物质的含量也显著要高于其他轮次基酒。四轮、五轮、六轮次中酚类物质的质量浓度较为接近。通过对基酒及成品酒中酚类化合物的研究，可以为企业积累数据，指导企业改进生产工艺，稳定酒中酚类化合物含量，对提升白酒品质具有重要意义。