大熊猫细胞色素C氧化酶亚基I基因的克隆及生物信息学分析

凌珊珊，王平峰，黄晓宇，黄 炎，屈元元，叶 刚，杨福兴

（1.中国大熊猫保护研究中心，四川 都江堰 611830；2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；3.四川农业大学动物科技学院，四川 成都 611130）

细胞色素氧化酶（COX）位于线粒体内膜，是呼吸链中唯一能够将氧还原成水的复合物，在能量产生过程中发挥着至关重要的作用［1］。它由13 个结构亚基组成，COX I-III 由线粒体基因编码，形成细胞色素C氧化酶的催化核心［2］，其余10个亚基由核基因编码，参与调节酶的活性［3］。细胞色素氧化酶亚基I 由COX I 编码，是COX 亚基中最大、最保守的亚基，COX I 与CuB、血红素α3以及血红素α结合［4］。COX I 基因突变将影响COX I 多肽的翻译和呼吸链复合体IV 的组装，进而导致COX 缺失，临床表现出肌病、脑病、失明、听力丧失和周围神经病变等［5］。COX I 基因除参与线粒体能量代谢外，还可作为条形码基因用于研究物种进化及生物学分类［6］。

大熊猫作为我国特有的珍稀动物，被列为国家一级保护野生动物。迄今为止，关于大熊猫COX I蛋白序列和结构的研究鲜有报道。本研究利用基因克隆技术获取了COX I 基因序列，构建了大熊猫与其他动物的系统发育树，并对大熊猫COX I 核酸序列、编码蛋白的理化性质和结构等进行预测和分析。

1 材料与方法

1.1 材料 血样：大熊猫血样采集自四川卧龙中国大熊猫保护中心，所采集的血样加入适量Trizol 后冻存于液氮中。试剂：Trelief 5α大肠杆菌感受态细胞，PCR Mix，pGL3-protomer 载体及TreliefTMSoSoo Cloning Kit（北京擎科新业生物）；RNA 抽提试剂Trizol 试剂（赛默飞世尔）；逆转录试剂盒（南京诺维赞）；LB 肉汤培养基（海博生物）；切胶回收试剂盒（QIAuick生物）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank 公布的大熊猫COX I 基因序列，采用Snapgene 软件设计了一对同源臂引物。引物序列为：

HR-COX I-F：GCGTGCTAGCCCGGGCTCGA GATGTTCATTAACCGATGACT；HR-COX I-R：AATTGAGATGCAGATCGCTGATCTCGAGTTATT TCAGTATGACGTGGG。引物由北京擎科生物公司合成。

1.2.2 RNA 的提取与反转录 根据RNA 提取和反转录试剂盒说明书操作，提取大熊猫血液总RNA；随后进行反转录反应，反应结束后将生成的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 PCR扩增 将保存的cDNA作为模板进行PCR 扩增，反应结束后，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并在电泳结束后拍照。

1.2.4 克隆与测序 PCR 产物纯化后与载体连接，然后转化，产物于37 ℃培养过夜；将单个菌落扩菌后的菌液为模板进行PCR扩增，再送样测序。

1.2.5 大熊猫COX I蛋白的理化性质预测 使用ExPASy-ProtParam Tool 对大熊 猫COX I 蛋白 的分子式、等电点等理化性质进行分析，应用Proscale工具进行亲水性和疏水性预测。

1.2.6 大熊猫COX I蛋白二级结构和三级结构预测 使用ExPASy GOR Ⅳ 4.0 和PredictProtein分析COX I 蛋白的二级结构，用SWISS-MODEL预测COX Ⅰ蛋白的三级结构。

1.2.7 系统发育树构建 登录NCBI 下载北极熊、懒熊和眼镜熊等15个物种的COX I氨基酸序列，随后使用MEGA 7.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 大熊猫COX I序列分析及理化性质 电泳结果显示PCR 产物条带明亮，长度为1 600 bp 左右（图1）。测序结果使用Snapgene 软件拼接，结果显示大熊猫COX I 基因的长度为1 545 bp，碱基含量分别为：A 26.86%，C 23.11%，G 17.999%，T 32.04%，GC 含量为41.10%。经BLAST 比对，与已公布的COX Ⅰ基因（GenBank Accession NO：KU955847.1）的同源性为99.81%，共有3 个碱基存在差异：843 位（A 突变为G）、954 位（T 突变为C）和1 494 位（C 突变为T），但均不影响氨基酸编码。使用ExPASy-ProtParam Tool 分析其编码氨基酸序列，得出COX I 基因编码蛋白由514 个氨基酸组成，原子总数为8 027 个，分子式为C2687H4008N626O671S35，分子质量为56 939.27u（56.9ku），半衰期理论值为30 h；负电荷氨基酸残基数为24个，正电荷氨基酸残基数为17个，等电点为6.22；不稳定系数为29.04，属于稳定蛋白，脂肪指数为102.65，总平均亲水系数为0.704。

图1 PCR扩增产物电泳图

2.2 系统发育树 在序列比对的基础上，采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树，发现大熊猫COX Ⅰ氨基酸序列与其他熊科动物位于同一进化分支上（图2），其中与懒熊的相似度最高，达98.6%。

图2 系统发育树

2.3 亲水性和疏水性 如图3 所示，COX I 蛋白第441 位的丝氨酸残基的亲水性最强（分值为-2.511），第192位的丙氨酸的疏水性最强（分值为3.244）。整体来看，COX I 蛋白中疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸，属于疏水性蛋白质。

图3 大熊猫COX I蛋白亲水性和疏水性分析

2.4 蛋白质二级结构和三级结构 预测结果如图4所示，大熊猫COX I蛋白的二级结构包括α螺旋、延伸链和无规则卷曲，其中延伸链占37.94%，无规则卷曲占42.80%，α螺旋占19.26%。大熊猫COX Ⅰ蛋白的三级结构模型如图5所示，预测结构中含有α螺旋、无规则卷曲，与二级结构的预测结果一致。

图4 大熊猫COX I蛋白的二级结构预测

图5 大熊猫COX Ⅰ蛋白的三级结构预测

3 小结

本试验通过克隆测序获得了大熊猫COX I基因序列，经克隆测序得到的大熊猫COX I 基因核苷酸序列与NCBI 上公布的COX I 基因（GenBank Accession NO：KU955847.1）的同源性为99.81%，共有3 个碱基存在差异，但均不影响氨基酸编码。系统发育树结果显示大熊猫与懒熊、棕熊、北极熊、眼镜熊聚类成一簇，该结果与吴夏等［7］对四川黑熊的研究结果相似。本研究结果将为后续开展大熊猫的能量代谢和生物学进化提供参考。