乌贝肠胃胶囊质量标准及指纹图谱研究

热孜亚·艾力木江，李晓娟，陈良,2，赵翡翠,2

（1.新疆医科大学第四临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆中药炮制研究重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

乌贝肠胃胶囊来源于新疆医科大学附属中医医院脾胃病科的经验方，为现代中药复方制剂[1-3]。该处方由高良姜、肉桂、佛手、木香等9味药组成。本品的功效为温中健胃、止酸止痛，可用于治疗肝胃不和、脾胃虚寒、胃失通降[4]所致的胃腕疼痛、反酸烧心等；胃及十二指肠溃疡[5]和慢性胃炎[6]有上述证候的患者可使用。该方在我院自20世纪70年代即以“散剂”[7]形式应用于临床，后经我院脾胃科诸多医师临床反复验证，处方得到不断完善，尤其在我院首届全国名中医金洪元教授学术思想的指导下对处方进一步完善后，临床取得了良好的疗效。慢性胃炎、反流性食管炎和消化性溃疡等胃相关疾病是当今世界的常见病和多发病，目前西医治疗这些疾病的目的是缓解症状，改善胃黏膜炎症和溃疡表面，存在一定的局限性。对于胃脘痛的治疗，中医在调节机体功能、增强胃黏膜防御能力方面有很大的优势，且副作用小。乌贝肠胃胶囊全方共9味药，将原药材混合均匀，粉碎成细粉，灭菌制成胶囊剂，减少了其苦味，便于服用携带、贮存。

中药复方制剂的质量主要体现在其制剂的疗效、安全及稳定性等方面[8]。中药复方制剂成分复杂，单一指标很难代表制剂整体质量。因此，为了控制乌贝肠胃胶囊的综合质量定性和定量检测方法，本研究专门制订指纹图谱，对代表性成分进行质量控制。本研究通过中药指纹图谱[9-12]结合相似度评价[13]，以及运用相关化学模式系统聚类分析[14]与主成分分析[15]，的方法进行综合评价。旨在为乌贝肠胃胶囊的质量控制奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 2996高效液相色谱仪（美国Waters公司）；SI-234型电子天平（丹佛仪器有限公司）；SK250LHC型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；TDZ4-WS型台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；HHS-24型电热恒温水浴锅（上海锡仪试验仪器有限公司）；500A型多功能粉碎机（上海塞耐机械进出口有限公司）；AP-OIP型真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试剂 高良姜对照药材（批号：121263-201605）、去氢木香内酯对照品（批号：111525-201711）、木香烃内酯对照品（批号：524-200101）、佛手对照药材（批号：20933-201004）、胡椒碱对照品（批号：0775-200203）均购于中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。3批乌贝肠胃胶囊样品（批号分别为20190820，20200702，20200703）及10批阴性对照品由新疆医科大学附属中医医院制剂室自制。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 高良姜 取本品10g置于锥形瓶中，加入乙酸乙酯10mL，密封，超声提取15 min，提取液过滤后在水浴中蒸干，残留物用少量乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液。另取高良姜对照药材粉末0.25 g，同供试品的制备方法制备，作为高良姜对照药材溶液。按原处方比例，称取缺高良姜的其他药材，同供试品的制备方法取备，作为缺高良姜阴性对照品溶液。取上述3种溶液各5 μL分别点在H薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-冰乙酸（20∶2∶1）作为展开剂，展开，取出晾干，均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液显色。结果在与高良姜对照药材色谱相应的位置上，供试品色谱中显黄色荧光的斑点，完整清晰，且无阴性干扰。（见图1）

图1 高良姜薄层色谱鉴别图

2.1.2 木香 取本品5 g置于锥形瓶中，加入甲醇10 mL，密封，超声提取40 min，提取液过滤后挥干至约2 mL，作为供试品溶液。另取去氢木香内酯和木香烃内酯对照品，分别用甲醇稀释，制备成分别为每1 mL含1 mg的去氢木香内酯和木香烃内酯对照品溶液。按原处方比例，称取缺木香的其他药材，同供试品的制备方法制备，作为缺木香阴性对照品溶液。取缺木香阴性对照品溶液和供试品溶液各10 μL、去氢木香内酯对照品溶液和木香烃内酯对照品溶液各1 μL分别点在G薄层板上，以石油醚-苯-乙酸乙酯（7∶2∶1）作为展开剂展开，取出，晾干，喷洒5%香草醛硫酸乙醇溶液至显色清晰。结果在与去氢木香内酯和木香烃内酯对照品色谱相应的位置上，供试品色谱中显相同颜色的斑点，且阴性对照品无干扰。（见图2）

图2 木香薄层色谱鉴别图

2.1.3 佛手 取本品10 g置于锥形瓶中，加入无水乙醇10 mL，密封，超声提取40 min，提取液过滤后水浴蒸干，将残留物用1 mL无水乙醇溶解，作为供试品溶液。另取佛手对照药材1 g同供试品制备方法制备，作为佛手对照药材溶液。按原处方比例，称取缺佛手的其他药材，同供试品的制备方法制备，作为缺佛手阴性对照品溶液。取缺佛手阴性对照品溶液和供试品溶液各15 μL、佛手对照药材溶液2 μL分别点在G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（3∶1）作为展开剂展开，取出，晾干，置于紫外灯光（365 nm）下检视。结果在与佛手对照药材色谱相应的位置上，供试品色谱中显蓝色的斑点，分离度好，阴性对照品无干扰。（见图3）

图3 佛手薄层色谱鉴别图

2.1.4 荜茇 取本品10 g置于锥形瓶中，加入无水乙醇10 mL，密封，超声提取35 min，提取液过滤后置于棕色容量瓶中，作为供试品溶液。另取胡椒碱对照品置于棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释，制备成每1 mL含4 mg胡椒碱的溶液，作为胡椒碱对照品溶液。按原处方比例，称取缺荜茇的其他药材，同供试品的制备方法制备，作为缺荜茇阴性对照品溶液。取缺荜茇阴性对照品溶液和供试品溶液各15 μL、胡椒碱对照品溶液3 μL，分别点在G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇（8∶2∶1）作为展开剂，展开，取出，晾干，均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液至显色。结果在与胡椒碱对照品色谱相应的位置上，供试品色谱中显淡黄色的斑点，阴性对照品无干扰。（见图4）

图4 荜茇薄层色谱鉴别图

2.1.5 浙贝母 取本品15 g依次加入6 mL浓氨水和30 mL二氯甲烷，过夜，提取液过滤后水浴蒸干，残留物用1 mL二氯甲烷溶解，作为供试品溶液。另取贝母素甲对照品，加入二氯甲烷适量，制备成每1 mL含2 mg贝母素甲的溶液，作为贝母素甲对照品溶液。按原处方比例，称取缺浙贝母的其他药材，同供试品的制备方法制备，作为缺浙贝母阴性对照品溶液。取缺浙贝母阴性对照品溶液和供试品溶液各20 μL、贝母素甲对照品溶液3 μL点在G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17∶2∶1）作为展开剂，展开，取出，晾干，喷洒现配的稀碘化铋钾进行显色。结果在与贝母素甲对照品色谱相应的位置上，供试品色谱中显红色斑点，阴性对照品无干扰。（见图5）

图5 浙贝母薄层色谱鉴别图

2.2 含量测定

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 称取桂皮醛适量，加甲醇稀释，配制成每1 mL中含0.100 2 mg桂皮醛的对照品溶液，用微孔滤膜过滤，即得。

称取去氢木香内酯适量，加甲醇稀释，配制成每1 mL中含0.100 5 mg去氢木香内酯的对照品溶液，用微孔滤膜过滤，即得。

称桂皮醛、去氢木香内酯各适量，加甲醇稀释，配制成每1 mL中含0.104 2 mg桂皮醛、0.103 7 mg去氢木香内酯的混合对照品溶液，用微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品约2.5 g置于容量瓶中，加无水乙醇5 mL，密封，超声45 min，置于离心管中，12 000 r/min离心2 min，取出，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2.3 阴性对照品溶液的制备 取除肉桂、木香外的药材，同供试品溶液的制备方法制备，用微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 方法学考察 桂皮醛为本方肉桂中的特有成分且肉桂为此方的君药，去氢木香内酯为本方木香中的特有成分，其含量相对较高，峰图独立并稳定，故选择该两种成分进行考察分析。

图6 HPLC图

2.2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2.1”项下的桂皮醛对照品溶液0.40、1.10、1.80、2.50、3.20、3.90 mL和去氢木香内酯对照品溶液0.25、0.75、1.25、1.75、2.25、2.75 mL至5 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，每两种混合均匀，分别进样测定。绘制标准曲线图，桂皮醛、去氢木香内酯的线性回归方程分别为：y=12 061.1x+118 970.8（x=0.999）、y=26 643.9x+469 295.5（r=0.999），表明桂皮醛、去氢木香内酯分别在0.008 0～0.078 0 mg/mL、0.005 0～0.055 0mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3.3 精密度试验 取乌贝肠胃胶囊（批号：20190820）按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，结果桂皮醛、去氢木香内酯峰面积RSD值分别为1.56%、0.50%，表明该仪器的精密度良好。

2.2.3.4 稳定性试验 取乌贝肠胃胶囊（批号：20190820）按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，放置0、3、6、12、24、48 h后进样测定，记录峰面积，结果桂皮醛、去氢木香内酯峰面积RSD值分别为1.69%、2.30%，表明乌贝肠胃胶囊在48 h内基本稳定。

2.2.3.5 重复性试验 取乌贝肠胃胶囊（批号：20190820）按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，进样检测，并记录峰面积，结果桂皮醛、去氢木香内酯峰面积RSD值分别为1.85%、2.00%，表明该方法重复性良好。

2.2.3.6 加样回收率试验 吸取“2.2.2.2”项下制备的供试品溶液1 mL，共6份，依次加入适量桂皮醛对照品溶液、去氢木香内酯对照品溶液，每份混匀后进样测定，记录色谱峰面积。结果桂皮醛、去氢木香内酯平均加样回收率分别为102.43%、98.42%，RSD值分别为2.60%、0.83%。（见表1）

表1 加样回收率试验结果

2.2.4 含量限度的确定 根据处方制作7批实验室小样，利用方法学已考察好的色谱条件，进行含量测定。结果得到每克胶囊以桂皮醛、去氢木香内酯计，分别应不得少于（0.166 6±0.001 1）mg/g、（0.198 0±0.004 5）mg/g。

2.3 HPLC指纹图谱

2.3.1 色谱条件 Symmetry C18色谱柱（4.6mm×150mm，5 μm），流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱：0～33 min，36%乙腈；36～50 min，50%乙 腈；60～66 min，70%乙 腈；70～80 min，90%乙腈；88～90 min，36%乙腈，流速：0.8 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：225 nm，进样量：20 μL。

应该争取更多的“常规报告”（regular或invited lecture）．“常规报告”的入选在很大程度上靠报告者在学术圈的知名度和研究工作的水平．现在常规报告的人选已经确定，需要常规报告的入选者今后围绕报告主题精心准备．

2.3.2 溶液的制备

2.3.2.1 混合对照品溶液的制备 称取桂皮醛、去氢木香内酯各适量，加甲醇稀释，配制成每1 mL中含0.102 6 mg桂皮醛、含0.101 9 mg去氢木香内酯的混合对照品溶液，用微孔滤膜过滤，即得。

称取胡椒碱、木香烃内酯各适量，加甲醇稀释，配制成每1 mL中含0.103 0 mg胡椒碱、含0.102 2 mg木香烃内酯的混合对照品溶液，用微孔滤膜过滤，即得。

2.3.2.2 供试品溶液的制备 按处方称取10批药材，每份混合均匀，打成细粉，过筛制备，各取约2.5 g放入容量瓶中，加无水乙醇5 mL密封，超声45 min，置于离心管中，12 000 r/min离心2 min，取出，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3.3 指纹图谱的建立 取“2.3.2.2”项下的供试品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件分别进行测定，记录峰面积并计算各共有峰的保留时间和峰面积。将测出的10个图谱数据全部导入到相似度评价系统软件里，以S1色谱图作为参照图谱，时间宽度为0.22，进行全谱峰匹配，建立指纹图谱，生成对照色谱图R，计算相似度。最终在特征图谱中选取了14个峰形较好的峰为共有特征峰。（见图7～8）采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，对剂色谱图进行指纹图谱分析。结果显示，10批制剂及对照指纹图谱相似度为0.943～0.990。（见表2）

图7 样品的HPLC 对照图谱

表2 相似度评价结果

图8 10 批样品的HPLC 叠加指纹图谱

2.3.4 指认共有峰 分别取“2.3.2.1”项下2种混合对照品溶液进样分析，结果与供试品的HPLC对照图谱进行对比指认。共有峰1、4、8、9号色谱峰分别指认为桂皮醛（保留时间为11.473 min）、胡椒碱（保留时间为33.348 min）、木香烃内酯（保留时间为46.268 min）、去氢木香内酯（保留时间为48.971 min）。（见图9）

图9 HPLC 色谱图

2.3.5 共有峰相关分析 10批样品中有14个共有峰。其中9号峰（去氢木香内酯）峰位置适中，面积大，稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。图谱中的共有峰相对保留时间和相对峰面积计算结果见表3～4。

表3 共有峰相对保留时间

表4 共有峰相对峰面积

2.4 聚类分析 采用SPSS 21.0软件对峰面积数据进行标准化处理，选择组间联接进行聚类分析。结果显示，10批样品可以聚为5类，其中S1、S7、S8聚为一类，S2为一类，S3、S4、S5聚为一类，S6为一类，S9、S10聚为一类。（见图10）

图10 聚类分析树状图

2.5 主成分分析 采用SPSS 21.0软件对样品中14个共有峰的峰面积进行主成分分析，结果得到3个主成分因子[17]，累积方差贡献率为86.675%＞80%。（见表5）采用最大方差法进行了正交旋转，得出旋转后的主因子载荷矩阵。（见表6）以3个主成分因子作为变量分别绘制出主成分分析的碎石图和得分图。（见图11～12）在主成分1中6、7、14号峰有负载荷，在主成分2中6、7、12号峰有负载荷，在主成分3中1、12、13号峰有负载荷，其余共有峰都有明显的正载荷。10批样品可分为5类，与“2.6”项下聚类分析结果一致。表6结果显示，4号峰（胡椒碱）对主成分1的载荷值高达0.900，8号峰（木香烃内酯）、9号峰（去氢木香内酯）对主成分2的载荷值分别为0.864、0.852，表明胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯3种成分的重要性在此评估中有主要的优势。

图11 主成分分析碎石图

表5 主成分分析特征值和方差贡献率

表6 旋转后的主因子载荷矩阵表

经相关分析得出，14个共有峰中2、3、4、5、8、9、10、11号峰的8种成分可视为乌贝肠胃胶囊的重要成分，对不同批次之间存在的差异成分具有一定的贡献。

图12 主成分分析得分图

3 讨 论

乌贝肠胃胶囊是由9味中药加工制成的复方制剂，具有镇痛、抗炎、抗胃溃疡等多种作用。该方中肉桂为君药，其有效成分桂皮醛在胃肠道具有抗炎、抗菌、抗胃癌等作用[18-19]。木香为臣药，其活性成分木香烃内酯具有抗肿瘤、抗炎等作用[20]；去氢木香内酯，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗溃疡等作用[21-23]。荜茇为佐药，其有效成分胡椒碱对沙鼠幽门螺杆菌诱导的胃炎具有抗炎作用[24]。因此，本研究以上述4种有效成分作为考察指标，开展了相关研究。

本研究通过对不同提取溶剂（无水乙醇、甲醇、水等）和超声提取时间（25、45、65、85、105 min）进行比较，结果发现使用无水乙醇超声提取45 min效果最佳。通过比较甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸液3种不同流动相，进行等度洗脱，采集图谱时间为90 min，结果发现乙腈-0.1%磷酸洗脱效果为最佳，各色谱峰分离好，保留时间与分离度均符合要求，便于分析。本研究在TLC鉴别的基础上对乌贝肠胃胶囊的质量进行测定，且建立了10批乌贝肠胃胶囊的指纹图谱，确认14个共有峰，并指认出了4个已知成分，分别为桂皮醛（1号峰）、胡椒碱（4号峰）、木香烃内酯（8号峰）、去氢木香内酯（9号峰）。由图谱可知，位置适中的去氢木香内酯峰面积大、分离度好、未有干扰峰且稳定，故选其为参照峰。

乌贝肠胃胶囊含多味中药材，其含量的检测存在一定的局限性，无法全面反映该制剂的总体质量。本研究所建立的高效液相色谱指纹图谱方法快速简便，重现性较好，为乌贝肠胃胶囊的整体质量控制奠定了基础。