层次分析法结合响应面法优化黄芩汤的提取工艺*

陈振东，施洋，张晓霞，马强，樊登峰，时欢欢

（克拉玛依市中西医结合医院/克拉玛依市人民医院，新疆 克拉玛依 834000）

黄芩汤出自张仲景的《伤寒论》，被誉为“万世治痢之祖”，由黄芩、白芍、大枣、灸甘草四味药材组成，具有清热解毒、止痢、和中止痛的功效，临床上常用于下利腹痛、身热口苦、热痢腹痛、舌红、脉弦数等症。方中君药黄芩可解少阳之里热，苦以坚之。临床上常用于治疗湿温、泻痢、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安等[1-3]。研究中多将黄芩中的黄酮类化合物黄芩苷[4-7]作为质量控制的一个重要指标。臣药白芍可解太阳之表热而行营气，酸以收之。现代药理学表明，白芍中的苷类化合物芍药苷[8-11]具有缓急止痛、解痉的功效。灸甘草、大枣为佐使药，用以益气和中，调和诸药，配合君、臣以加强治疗作用。研究中多将甘草中的黄酮类化合物甘草苷[12-14]作为质量控制的一个重要指标。因此，本研究将上述3种成分的含量作为检测指标，采用层次分析法（AHP）构造成对比较的判断优先矩阵，并获得各项指标的相对评分，确定待测指标的权重系数。通过Box-Behnken响应面法结合层次分析法设计试验，优选提取黄芩汤药材的最佳工艺参数，为后续黄芩汤的研究开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UltiMate3000系列高效液相色谱（HPLC）仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；UV-2501C紫外分光光度计（日本岛津公司）；CPA-225D型电子天平（德国Sartorius）。

1.2 试药 黄芩苷对照品（批号：110715-201619，含量：98.5%）、甘草苷对照品（批号：110916-201904，含量：97.5%）、芍药苷对照品（批号：110617-201814，含量：98.5%）均购自中国食品药品检定研究院。黄芩、白芍、甘草均购于安徽省亳州市华云中药饮片有限公司，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、豆科植物胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.的根茎，并均符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）有关规定。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）-乙腈（C），梯度洗脱（0～8 min，15%A∶55%B∶30%C；8～12 min 30%A→35%A，45%B→50%B，25%C→15%C；12～28 min，20%A∶50%B∶30%C），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为黄芩苷277 nm，芍药苷230 nm，甘草苷254 nm。（见图1）

图1 HPLC 色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷、甘草苷、芍药苷对照品适量，用甲醇分别配制成5.51、1.98、3.42 mg/mL的对照品储备液。精密吸取黄芩苷对照品储备液1.0 mL、甘草苷对照品储备液2.5 mL、芍药苷对照品储备液1.2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，混合摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取黄芩汤（黄芩15 g，白芍15 g，甘草10 g，大枣10 g）药材50 g，10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，70%乙醇定容至250 mL，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性对照品溶液的制备 分别称取缺黄芩、缺甘草、缺白芍的阴性对照药材，分别加入10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，70%乙醇定容至250 mL，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 空白对照溶液的制备 精密量取甲醇溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液及空白对照溶液各10 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，结果见图1。黄芩苷、芍药苷、甘草苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰计算均在8 220以上，说明在选定的色谱条件下，测定效果良好。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.2、1.4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，依次用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。分别取各系列混合对照品溶液进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标，溶液的质量浓度（X，mg/mL）为横坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取同一供试品溶液连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，结果黄芩苷、芍药苷、甘草苷的峰面积RSD分别为1.14%、1.19%和1.35%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、6、8、12、24 h进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量。结果黄芩苷、芍药苷、甘草苷峰面积的RSD分别为1.20%、1.18%和1.37%，其峰形和含量变化不大，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 取黄芩汤药材6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量，结果黄芩苷、芍药苷、甘草苷含量的RSD分别为1.24%、1.15%和1.34%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 称取黄芩汤药材约25 g，共6份，分别按处方药材浓度的100%比例加入各对照品溶液，测得黄芩苷、芍药苷、甘草苷的平均回收率分别为99.82%、98.80%、99.02%，RSD（n=6）分别为1.30%、1.20%、1.37%。加样回收率试验结果见表2。

表2 加样回收率测定结果（n=6）

2.4 出膏率测定 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液50 mL，置于已恒重过的蒸发皿中（W1），水浴蒸干,105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称重（W），按下式计算浸膏得率。出膏率=[（W-W1）×V/（M×50）]×100%（W1为蒸发皿的质量，W为浸膏与蒸发皿总质量，V为溶液体积，M为药材称样量）。

2.5 提取工艺综合评分指标的确定 根据复方中药味君、臣、佐、使配伍规律，采用层次分析法对出膏率和指标性成分含量作为权重指标予以量化。当一致性比例因子CR＜0.1时，判断矩阵具有一致性[15-17]。

本研究根据黄芩汤药材中活性成分黄芩苷、芍药苷、甘草苷含量及出膏率4项指标为考查内容采用层次分析法构造成对比较的判断优先矩阵，并获得各项指标的相对评分（评分标准可参见文献[15-17]的判断矩阵1-9标度法）。（见表3）

表3 目标成对比较判断优先矩阵

2.5.3 一致性检验 根据矩阵最大特征根公式（1）～（3）计算随机一致性比率。

式中m为受检验层次的次目标数，CI为一致性检验因子，RI为平均随机一致性指标，CR为矩阵最大特征根，表示一致性比例因子。

2.6 单因素试验 本试验以黄芩苷、芍药苷、甘草苷的含量及出膏率的综合评分进行评估，优选最佳因素。

2.6.1 乙醇浓度的考察 称取黄芩汤药材约50 g，粉碎过10目筛，加入10倍溶剂，提取2次，提取时间2 h，进行提取溶剂的考察。结果表明，以乙醇浓度为70%时各项含测指标的综合评分最高，故选择70%乙醇为提取溶剂。（见表4）

表4 单因素考察乙醇浓度结果

2.6.2 提取次数的考察 称取黄芩汤药材约50 g，粉碎过10目筛，加入10倍量70%乙醇，提取时间2 h，进行提取次数的考察。结果表明，提取次数为3时各项含测指标的综合评分最高。（见表5）2.6.3 提取时间的考察 称取黄芩汤药材约50 g，粉碎过10目筛，加入10倍量70%乙醇，提取2次，进行提取时间的考察。结果表明，提取时间为1 h时，各项含测指标的综合评分最高，故选择提取时间1 h。（见表6）

表5 提取次数考察结果

表6 提取时间考察结果

2.7 响应面试验

2.7.1 试验结果 在单因素优选的基础上结合响应面法对乙醇浓度（A）、提取次数（B）、提取时间（C）3个主要因素进行考察，以黄芩苷、甘草苷、芍药苷的含量及出膏率为考察指标，各因素选取3个水平（-1、0、1），进行响应面设计，优选合理的条件组合，各因素水平见表7，试验安排与试验结果见表8，对试验数据进行方差分析结果见表9。

表7 因素与水平表

表8 响应面试验与结果

续表8：

采用Design Expert 12.0软件进行响应面分析，以综合评分为响应值，通过二阶多项式进行回归。得回归方程Y=97.83-0.69A +2.71B +0.73C +0.47AB-0.22AC-1.18BC-14.07A2-1.43B2-3.98C2。由表9可知，建立的数学模型极显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型中的A、B、C、A2、B2、C2显著，其他不明显。结合模型（P＜0.000 1）及失拟项（P=0.228 1>0.05），说明试验误差较小。根据二次多项式模型，应用Design Expert 12.0软件绘制三维响应曲面。由回归模型进行预测分析，综合评分的预测值98.83。最优提取条件为70%乙醇，回流提取2次，提取时间1 h。（见图2）

表9 回归模型的方差分析结果

图2 综合评分响应面图

2.7.2 验证试验 根据响应面优化的最佳条件，平行称取3份黄芩汤药材约50 g，加入10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h。结果表明，黄芩苷、芍药苷、甘草苷的含量及出膏率的综合评分的相对误差均小于5%，说明最佳提取工艺稳定，重现性好。（见表10）

表10 验证试验结果

3 讨 论

采用HPLC法测定黄芩汤中黄芩苷、芍药苷、甘草苷的含量过程中，尝试了多种色谱系统，筛选流动相初期曾以甲醇-0.2%磷酸（40∶60）为流动相。色谱图显示仅黄芩苷、芍药苷出峰，且峰形对称性及分离度均较差，因此该洗脱系统不适用于本研究。考虑到甘草中的甘草苷未出峰，因此改换甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱。色谱图显示黄芩苷、芍药苷、甘草苷出峰时间较合适且峰形对称、分离度佳。因此，选用甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈为流动相用于测定黄芩苷、芍药苷、甘草苷的含量。该方法操作简便、重现性好，一个色谱条件可同时测定黄芩苷、芍药苷、甘草苷的含量，在保证样品稳定性的前提下节省了大量时间。

3.1 含测指标加权系数的确定 由于黄芩汤药材的成分复杂、指标成分较多，对于其提取工艺而言，选择合适的指标成分尤为重要。本研究根据黄芩汤中药材活性成分的重要程度，采用层次分析法对各成分进行系数加权，以加权后综合评分为因变量，不仅能全面地反映各味药材在黄芩汤中的作用，也能直观地反映整体提取工艺。

3.2 Box-Behnken响应面法 通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，能够准确表示试验设计与优化结果，准确度高、可预测性强。通过建立综合评分与关键工艺参数的数学模型，并运用该模型预测最佳工艺为：70%乙醇，回流提取2次，每次1 h。验证试验结果与预测值相比，其误差均小于5%，说明利用Box-Behnken响应面法设计提取工艺稳定、可靠，可为工业化生产提供一定的参考价值。

3.3 波长的选择 由于黄芩苷、芍药苷、甘草苷三者的最大吸收波长不同，为保证检测的灵敏度和响应值最高，根据试验筛选，发现黄芩苷277 nm、芍药苷230 nm、甘草苷254 nm波长处均有较强吸收，为保证色谱峰峰度及分离度较佳，故选择其作为检测波长。