银杏叶多糖提取工艺优化及其活性研究*

戴智强，高青青，贾丽娟，国大亮，商学良，刘玉璇

（1.天津中医药大学中医学院，天津 301617；2.华北理工大学心理与精神卫生学院，河北 唐山 063210）

银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科、银杏属多年生落叶乔木，是植物界中名副其实的“活化石”，其叶、种子、花粉、树根等都有不同药用价值[1]。银杏叶为银杏树的干燥叶片，主要含有黄酮类、萜内酯类、酚酸类、聚戊烯醇类、甾体类、多糖类等多种化学成分[2]。现代研究表明，银杏叶多糖具有抗炎[3]、抗肿瘤[4]、抗肝纤维化[5]、增强免疫力[6]、降血糖[7]等药理作用，并具有治疗抑郁症的潜在活性[8]，具有较高应用价值。目前，银杏叶多糖的提取方法有热水浸提法[9-10]和超声辅助法[11-12]。热水浸提法操作简单，但需要高温，提取时间较长；超声辅助法要求复杂，不利于大规模生产。本研究使用纤维素酶辅助提取银杏叶中多糖，与热水浸提法和闪式提取法进行比较，并利用响应面法优化提取工艺条件，同时对银杏叶多糖的抗氧化活性、清除亚硝酸盐活性和免疫活性进行研究，旨在为银杏叶多糖的综合利用与开发提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 材料与试剂 银杏叶由河北大中药业有限公司提供，经天津中医药大学中医学院刘玉璇教授鉴定为银杏叶。纤维素酶（酶活力：315 000 U/g）购自天津市光复精细化工研究所；1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（批号：C11482940）购自上海麦克林生科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（批号：421L032）购自北京索莱宝科技有限公司；维生素C溶液购自天津市光复精细化工研究所；所有试剂为分析纯；无水葡萄糖对照品（批号：1122A0220，含量：98%）、环磷酰胺（批号：6055-19-2）、免疫球蛋白G（IgG）试剂盒（批号：20220217）、免疫球蛋白A（IgA）试剂盒（批号：20220219）、免疫球蛋白M（IgM）试剂盒（批号：20220217）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器 HH-4型数显恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司）；800型电动离心机（金坛区西城新瑞仪器厂）；JHBE-50S型闪式提取器（北京金鼐科技发展有限公司）；TU-1810型紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 实验动物 6～8周龄SPF级雄性ICR小鼠20只，体质量（30±3）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：No.110322220100150962，动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0008。小鼠于温度为20～26℃、相对湿度为40%～60%、12 h/12 h昼夜光照循环、自由取食和饮水的条件下饲养，实验结束时采用颈椎脱臼处死。本实验遵循天津市医学实验动物保护中心的指导原则，方案经易生源基因科技(天津)有限公司的动物伦理委员会批准，严格按照动物伦理要求规范进行。

2 方 法

2.1 不同提取方法的考察

2.1.1 提取工艺路线 银杏叶→洗净→无水乙醇脱脂→烘干→粉碎过筛（80目）→称量→提取方法考察→减压过滤→滤液浓缩→4倍体积无水乙醇醇沉→4 ℃静置12 h以上→离心（3500 r/min，10 min）→80%乙醇洗涤→干燥得银杏叶多糖。

2.1.2 热水浸提法单因素试验 按照上述路线，进行水浴加热提取，考察单个因素在提取过程中的影响，考察因素与区间有：液料比（10、20、30、40、50 mL/g）；水提温度（50、60、70、80、90 ℃）；水提时间（1、2、3、4、5 h）。

2.1.3 酶解辅助法单因素试验 按照“2.1.1”项下路线，在水浴加热提取基础上加入纤维素酶辅助提取，考察单个因素在提取过程中的影响，考察因素与区间有：液料比（10、20、30、40、50 mL/g）；酶解温度（30、40、50、60、70 ℃）；酶解时间（30、60、90、120、150 min）；酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）；酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）。

2.1.4 闪式提取法单因素试验 按照“2.1.1”项下路线，将银杏叶片在一定温度下浸泡一段时间后利用闪式提取器高速粉碎，考察单个因素在提取过程中的影响，考察因素与区间有：液料比（20、30、40、50、60 mL/g）、浸泡温度（50、60、70、80、90 ℃）；闪式提取时间（40、60、80、100、120 s）。

2.1.5 多糖含量的测定 采用3,5-二硝基水杨酸法测定多糖含量[13]，使用紫外可见光分光光度计在540 nm处测定吸光度，以蒸馏水为空白对照，以葡萄糖质量浓度C（mg/mL）为横坐标和吸光度A为纵坐标，得回归方程A=1.674C-0.132 4，r=0.998 9，线性范围为0.101 6～0.609 6 mg/mL。

称取不同方法提取所得的多糖在蒸馏水中溶解，并按1∶1体积加入盐酸（6 mol/mL），混匀后在沸水浴中加热1 h，冷却，用氢氧化钠中和水解液至中性，过滤后定容，从中取1 mL测定吸光度值，计算多糖提取率，比较方法优劣。公式如下：

式中：C为测定样品中多糖质量浓度（mg/mL）；V为定容体积（mL）；m2为试验提取的总多糖质量（mg）；m1为称取的多糖质量（mg）；M为银杏叶粉末质量（g）。

2.2 响应面试验设计 为进一步确认提取方法的最佳提取工艺条件，以单因素试验为基础，选取液料比（A）、酶用量（B）、酶解温度（C）为自变量（其他条件固定为酶解时间90 min、酶解pH=5.0），以多糖提取率为响应值，运用软件Design Expert 10.0.3设计响应面试验进行优化，试验设计因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平参数

2.3 多糖精制 最佳工艺下获得的银杏叶多糖，在使用木瓜蛋白酶脱蛋白和HPD100型大孔树脂脱色处理后，灌装至透析袋中，4 ℃透析72 h，冷冻干燥，得淡黄色粉末，即精制后银杏叶多糖，纯度为72.40%。

2.4 DPPH自由基清除率测定[14-15]取2.0mL DPPH（0.1mmol/mL），加入2.0 mL不同浓度的多糖溶液（0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL），混匀，避光静置30 min后，在517 nm处测定吸光度，记为A1；用乙醇代替DPPH溶液测定吸光度值记为A2；用蒸馏水代替多糖溶液测定吸光度值记为A0。以VC溶液作对照，计算公式如下：

2.5 亚硝酸盐清除率测定[16]取2.0 mL亚硝酸钠标准溶液（5 μg/mL），加入1.0 mL不同浓度的多糖溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），混匀，40 ℃加热10 min，加入2.0 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5 min，再加入1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，混匀后静置15 min，定容至50 mL，在538 nm处测定吸光度值，记为A1；用蒸馏水代替标准液测定吸光度值记为A2；用蒸馏水代替多糖溶液测定吸光度值记为A0，以VC溶液作对照，计算公式如下：

2.6 免疫活性研究 环磷酰胺是一种烷基化试剂，具有免疫抑制、减少白细胞等作用[17]，常用于建立免疫低下模型[18]。ICR小鼠在实验环境中维持正常光照与喂食进行适应性喂养1周。采用随机数字表法将20只小鼠分为正常组、模型组、银杏叶多糖低剂量组、银杏叶多糖中剂量组、银杏叶多糖高剂量组，每组4只。除正常组外，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺[40 mg/（kg·d）]；正常组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，共5 d。若小鼠出现食欲不振、体质量下降，血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）水平明显下降等情况则说明模型制备成功。银杏叶多糖低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给予银杏叶多糖溶液（由生理盐水配置），剂量分别为100、200、400 mg/（kg·d）；正常组和模型组小鼠灌胃给予等体积生理盐水，共14 d。末次给药后12 h，取小鼠肝脏、脾脏、胸腺，计算器官指数；收集血清，测定免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量。

2.7 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 提取方法的选择 各单因素试验平行3次，比较提取率。酶解辅助法提取银杏叶多糖效果明显优于其余两种方法（P＜0.05或P＜0.01），故选择酶解辅助法进行后续响应面优化试验。（见表2）

表2 不同方法提取银杏叶多糖的提取率（mg/g）

3.2 响应面法优化银杏叶多糖提取工艺条件

3.2.1 响应面试验设计及结果 使用软件Design-Expert 10.0.3中Response Surface的中心复合设计模块设计响应面试验，以获得酶解辅助法提取银杏叶多糖最佳提取工艺条件，试验参数与结果见表3。

3.2.2 方差分析与回归模型显著性检验 通过软件Design-Expert 10.0.3对表3中结果进行方差分析，以多糖提取率为响应值Y得到回归方程：Y=25.11+1.02A-0.64B+0.40C+0.11AB-0.24AC-0.25BC-2.01A2-2.27B2-1.89C2。3个因素与响应值之间存在非线性关系。回归方程显著性检验与方差分析结果见表4，可知该模型回归显著（P＜0.000 1），且模型失拟项不显著（P=0.095 4＞0.05），其中R2=0.974 7，校正R2=0.951 9，说明模型拟合较好，具有较高可信度，可以解释95.19%响应值的变化；结合方差分析结果可以看出FA（31.06）＞FB（12.30）＞FC（4.85），即对银杏叶多糖提取率的影响大小依次为A、B、C。

表3 中心复合设计试验参数及结果

表4 方差分析与显著性检验

3.2.3 响应面分析 根据模型的回归方程，对两两因素间交互作用进行分析，制作液料比（A）、酶用量（B）、酶解温度（C）响应曲面分析图，见图1～3。因素间交互作用越显著，曲面坡度越陡峭，等高线越密集越偏椭圆形。结合各图中3D响应曲面平滑程度与等高线轮廓情况可知，液料比（A）与酶用量（B）、料液比（A）与酶解温度（C）、酶用量（B）与酶解温度（C）之间因素交互作用不明显，与方差分析结果相同。

图1 液料比与酶用量的交互作用响应面图

图2 料液比与酶解温度的交互作用响应面图

图3 酶用量与酶解温度的交互作用响应面图

3.2.4 最佳提取工艺验证 通过软件Design Expert 10.0.3对回归模型进行二次回归，预测液料比32.44 mL/g、酶用量1.93%、酶解温度51.03 ℃为酶解辅助法提取银杏叶多糖最佳工艺条件，预测提取率为25.30 mg/g。根据实际试验条件与操作进行修正为液料比32 mL/g、酶用量1.9%、酶解温度51 ℃，并进行3次试验验证，提取率结果为（25.08±0.33）mg/g。实际值与理论值相近，表明优化过程所获得工艺条件参数良好、可靠，该提取工艺模型能够较好预测银杏叶多糖提取工艺。

3.3 DPPH自由基清除率测定结果 随银杏叶多糖溶液浓度增加，其清除DPPH自由基的能力迅速上升；当银杏叶多糖溶液浓度为1.0 mg/mL时，DPPH自由基清除率为92.76%，说明银杏叶多糖有较强的DPPH自由基清除效果。（见图4）

图4 DPPH 自由基清除率

3.4 亚硝酸盐清除率测定结果 银杏叶多糖的清除亚硝酸盐能力随浓度增加而逐渐增强，均优于同浓度下的VC溶液；当银杏叶多糖溶液浓度为1.0 mg/mL时，亚硝酸盐清除率达90.03%，说明银杏叶多糖具有较强的亚硝酸盐清除能力。（见图5）

图5 亚硝酸盐清除率

3.5 免疫活性实验结果 与正常组比较，模型组小鼠肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数及血清中IgG、IgM、IgM含量均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。银杏叶多糖中剂量组小鼠脾脏指数明显高于模型组（P＜0.05）；银杏叶多糖高剂量组小鼠肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数均明显高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），说明高浓度银杏叶多糖溶液能够有效修复环磷酰胺对免疫器官的损伤。银杏叶多糖中剂量组小鼠血清中IgG含量明显高于模型组（P＜0.05）；银杏叶多糖高剂量组小鼠血清中IgG、IgM、IgM含量均明显高于模型组（P＜0.01），说明高浓度银杏叶多糖对免疫球蛋白的分泌抑制具有良好恢复效果。（见表5）

表5 各组小鼠器官指数及血清免疫球蛋白含量比较（±s）

表5 各组小鼠器官指数及血清免疫球蛋白含量比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

4 讨 论

银杏叶多糖提取率除受方法和工艺的影响外[19]，同时受产地、采摘季节的客观因素影响[20]。本试验中银杏叶提取率最高可达2.6%。酶解辅助法利用酶破坏植物细胞壁，使有效成分溶出，操作简单而高效[21]。本研究比较了3种不同提取方法单因素试验的提取率，结果显示纤维素酶解辅助法能够有效提高银杏叶多糖的提取率，相比于其他提取方法存在一定优势。响应面优化试验方差分析结果显示，影响提取率因素大小关系与单因素试验中的因素影响程度相符，且响应面试验预测工艺下的预测结果与实际验证试验结果接近，进一步说明该优化工艺参数良好、可靠。

银杏叶多糖的抗氧化和清除亚硝酸盐活性与银杏叶多糖溶液浓度之间均呈现出良好的量效关系，且银杏叶多糖清除亚硝酸盐的效果优于VC溶液。脾脏、胸腺、肝脏是体内的免疫器官，均参与机体免疫应答环节中[22]。本研究中3个浓度银杏叶多糖溶液均能增加免疫低下小鼠的免疫器官指数，呈现浓度依赖性，其中银杏叶多糖高剂量组效果明显优于其余两组，说明银杏叶多糖能够对环磷酰胺所致免疫器官的萎缩产生逆转功效，有提升机体免疫的作用。当机体受抗原刺激时，免疫应答可由淋巴B细胞转化的浆细胞分泌免疫球蛋白的方式进行，阻断其对机体危害的同时，也使抗原失去作用[23]。银杏叶多糖低、中、高剂量组小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量均高于模型组，且银杏叶多糖高剂量组效果显著，呈浓度依赖性，说明银杏叶多糖能够增强免疫细胞分泌免疫球蛋白，进而增强机体免疫。银杏叶多糖能够通过以上方式增强免疫系统的调节能力。

综上所述，本研究采用的纤维素酶解辅助法提取银杏叶多糖的方法具有操作简易、条件温和、能耗低等特点，对于实际生产具有借鉴意义。银杏叶多糖可作为一种天然植物来源成分，用做抗氧化剂、亚硝酸盐清除剂或免疫增强剂。