薯蓣皂苷通过ERα/miR503/RANK信号通路抑制破骨细胞生成

蒋太平 关智宇 刘志伦 李成蹊 刘昭明

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000

2.贵州中医药大学第一附属医院骨伤科，贵州 贵阳 550001

骨质疏松症是一种代谢性骨骼疾病，好发群体为中老年人，其特点是骨量减少、骨组织微结构被破坏，从而导致骨组织承受载荷的能力下降，骨组织的脆性增加[1]。骨质疏松是骨折的主要危险因素，其带来的后果严重影响着中老年人的生命健康和生活质量[2-3]。临床上治疗骨质流失的方法较多，但多数效果不佳或存在严重不良反应[4-5]。因此，笔者期望从中医药宝库中探寻更安全、有效的治疗骨质疏松症的方法。

薯蓣皂苷同时广泛存在于薯蓣科、百合科、石竹科和蔷薇科等药用植物中，前期的研究发现，薯蓣皂苷可能是山药(Dioscoreae Rhizoma)、黄精(Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute)等补肾健脾类中药发挥抗骨质疏松作用的主要有效成分之一[6-7]。通过生物信息学研究显示ER通路可能是薯蓣皂苷抗骨质疏松作用的重要调控途径之一，且薯蓣皂苷具有雌激素样活性，可通过多途径调控骨吸收和骨形成的平衡，具有良好的抗骨质疏松作用[8-9]。

ERα/miR-503/RANK是参与破骨细胞形成和骨吸收功能的通路之一，ERα通过上调miR-503-5p的表达，靶向抑制RANK的表达，对下游的TRAP、CTSK、MMP-9等破骨标志性基因的表达产生调控，介导破骨细胞的分化形成和功能[10]。因此，本研究利用RANKL诱导小鼠破骨细胞前体细胞(RAW264.7)分化成破骨细胞的模型，从ERα/miR-503/RANK通路探讨薯蓣皂苷抑制破骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和试剂

Raw264.7细胞(BNCC354753，北纳生物)，完全DMEM培养基(KGM12800 S，凯基生物)，FBS(10099-141，Gibco)，RANKL(HY-P73388，MCE)，雌二醇(S30633，源叶生物)，薯蓣皂苷元(B21177，源叶生物)，CCK-8法细胞增殖检测试剂盒(KGA317，凯基生物)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色液(G1492，Solarbio)，Trizon Reagent(CW0580 S，CWBIO)，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01，Vazyme)，超纯RNA提取试剂盒(CW0581 M，CWBIO)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme)，miRNA提取试剂盒(CW0627 S，CWBIO)，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-02，Vazyme)，BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M，Elabscience)，RIPA细胞裂解液(C1053，北京普利莱基因技术有限公司)，Rabbit Anti ERα(AF6058，Affinity，1/1000)、Rabbit Anti RANK (DF12532，Affinity，1/1000)、Mouse Anti-β-Actin (HC201，TransGen Biotech，1/2000)，HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301，Servicebio，1/2000)，HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(GB23303，Servicebio，1/2000)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分组：雌二醇与薯蓣皂苷采用DMSO分别溶解后配置成5 μg/mL的雌激素溶液和1 μmol/L、2.5 μmol/L的薯蓣皂苷溶液。小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)细胞置于39 ℃干式恒温加热器中复苏后，转移至细胞培养瓶，待细胞密度至80%～90%时对细胞进行传代，经1×PBS洗两遍、0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化、细胞培养基终止消化、6 000 r/min离心3 min处理后，再根据实验需要进行种板。为比较薯蓣皂苷与雌激素对破骨分化的抑制作用，实验分为4组：模型对照组、雌激素组、低剂量薯蓣皂苷组、高剂量薯蓣皂苷组，接种于含50 μg/L的RANKL完全培养基2 mL，处理7 d后，分别更换为含5 μg/mL雌二醇的完全培养基2 mL、含1 μmol/L薯蓣皂苷元的完全培养基2 mL与含2.5 μmol/L薯蓣皂苷元的完全培养基2 mL，培养48 h后进行后续检测。

1.2.2CCK8细胞毒性测定：将RAW264.7细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，分为6组，每组设5副孔，细胞贴壁后加入不同浓度的薯蓣皂苷(0、0.1、1、2.5、5、10 μmol/L)进行培养，48 h后将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100 μL，每孔加入10 μL CCK8试剂，37 ℃培养箱中孵育2 h后通过酶标仪在450 nm波长检测吸光度(optical density，OD)值。通过下述公式计算细胞相对存活率：OD给药组/OD对照组×100%。

1.2.3抗酒石酸碱性磷酸酶染色(TRAP染色)：吸除皿中的培养基，自然晾干后予TRAP固定液4 ℃固定60 s，水洗晾干后切片入TRAP孵育液，37 ℃温箱避光浸染45～60 min，水洗后予甲基绿染色液染色2～3 min，水洗、晾干后镜检。染色后破骨细胞胞浆被染成紫红色，细胞核被甲基绿染成绿色。每孔随机选取5个不相邻视野求均值，计数每组TRAP阳性多核细胞数。

1.2.4实时定量PCR[11]：根据试剂盒说明分别提取细胞microRNA和总RNA，反转录合成cDNA后，配置成20 μL的反应体系，在荧光PCR仪[CFX ConnectTM实时，伯乐生命医学产品(上海)有限公司]上按照反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃反应10 s变性，58 ℃反应30 s退火，72 ℃反应30 s延伸，进行40次循环。

引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成，U6是miR-503的参考基因，β-actin是ERα、RANK、TRAP、MMP9、CTSK的参考基因，每组设3个复孔，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.5Western blot检测：加入RIRP细胞裂解液，12 000 r/min离心10 min，取上清；BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白水平，95 ℃加热5 min使蛋白变性。将样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜上，加入脱脂牛奶封闭2 h；分别加入RANK抗体(1/1 000)、ERα抗体(1/1 000)和β-Actin抗体(1/2 000)，4 ℃孵育过夜；与HRP标记的山羊抗兔IgG抗体室温孵育2 h；通过超高灵敏度化学发光成像系统处理印迹，进行曝光。

1.3 统计学方法

数据以平均值±标准差表示，所有实验至少进行3次。统计分析采用SPSS 21.0软件进行分析，数据符合正态分布且方差齐性较好，多组样本比较采用单因素方差分析(ANOVA)，采用最小显著性差异法(LSD)-t检验进行组间两两比较，组间显著性差异为P<0.05，以*表示。

2 结果

2.1 薯蓣皂苷在0.1～10 μmol/L浓度下对RAW264.7细胞没有细胞毒性

培养48 h后，CCK-8实验结果显示，薯蓣皂苷的浓度为0.1～10 μmol/L时对RAW264.7细胞活性无明显毒性作用。0.1、1、2.5、5、10 μmol/L浓度的薯蓣皂苷干预与不使用薯蓣皂苷干预比较，差异无统计学意义(P>0.05)。薯蓣皂苷在0～10 μmol/L浓度内均未显示出毒性作用。见图1。根据CCK-8结果及其他参考文献[12]，选取1 μmol/L(低剂量)和2.5 μmol/L(高剂量)进行后续实验。

图1 不同浓度薯蓣皂苷对RAW264.7细胞活力的影响Fig.1 Effect of different concentrations of dioscin on the viability of RAW264.7 cells

2.2 薯蓣皂苷抑制RANKL诱导的破骨细胞生成

TRAP染色结果如图2、表2所示，各组均出现融合生长，胞质染色较深，形态大的TRAP阳性多核细胞。与RANKL模型组比较，雌激素组和高剂量(2.5 μmol/L)薯蓣皂苷组阳性细胞显著减少(P<0.05)。低剂量组(1 μmol/L)阳性细胞数目平均值虽然低于RANKL组，但差异不具有统计学意义(P>0.05)。

图2 各组Trap染色结果A：RANKL诱导组；B：雌激素组；C：低剂量薯蓣皂苷组；D：高剂量薯蓣皂苷组 Fig.2 Trap staining results of each groupA： RANKL-induced group; B： Estrogen group; C： Low-dose dioscin group; D： High-dose dioscin group

表2 各组TRAP染色阳性细胞计数Table 2 TRAP staining positive cell count in each group

2.3 对破骨细胞相关基因表达的影响

通过实时定量PCR检测各组破骨标志基因的表达，结果显示，与RANKL模型组比较，雌激素组与低、高剂量薯蓣皂苷组中MMP-9、CTSK、TRAP的基因表达均被抑制(P<0.05)。见图3。

图3 qPCR检测破骨标志性基因(TRAP、CTSK和MMP-9)Fig.3 Osteoclast-specific gene expression (TRAP, CTSK, and MMP9) was analyzed with qPCR注：与RANKL组比较，*P<0.05。

2.4 对ERα/miR-503/RANK通路表达的影响

实时定量PCR结果显示，与RANKL组相比，雌激素与薯蓣皂苷组均能不同程度的激活ERα、miR-503-5p，并抑制RANK mRNA的表达(P<0.05)。Western blot结果显示，相较于RANKL组，ERα在雌激素组和薯蓣皂苷组的表达量均升高，RANK的表达量在雌激素组和薯蓣皂苷组均降低(P<0.05)。见图4。以上结果说明雌激素与薯蓣皂苷对ERα/miR-503/RANK信号通路均有一定的激活作用。

图4 A：通过qPCR检测雌激素和不同浓度的薯蓣皂苷对破骨细胞中ERα、miR-503和RANK表达的影响；B：通过Western blot检测各组细胞中ERα和RANK蛋白的表达量Fig.4 A：The effects of estrogen and different concentrations of dioscin on the expression of ERα, miR-503, and RANK in osteoclasts were analyzed with qPCR; B：The expression of ERα and RANK proteins in each group of cells was detected with Western blotting注：与RANKL组比较，*P<0.05。

3 讨论

破骨细胞在骨骼的动态平衡中扮演着重要的角色，是负责骨吸收的主要细胞。破骨细胞的过度活化可导致骨吸收、骨流失，甚至引发骨折。因此，破骨细胞作为一个骨质疏松症的重要治疗途径受到大量关注。而我国传统补肾健脾的中药在临床上对骨质疏松症有着大量应用，现代药理学研究也显示山药、黄精等中药具有良好的抗骨质疏松作用[13-16]。薯蓣皂苷作为补肾健脾类中药山药、黄精的主要活性成分之一，最近的研究也显示薯蓣皂苷可调控骨吸收和骨形成的平衡，具有良好的抗骨质疏松作用，但其机制仍需进一步研究[6-9]。

在骨骼的发育、骨质重塑及骨量维持中ERα/miR-503/RANK信号通路起着关键作用，破骨细胞表面的ERα与雌激素结合后，可通过上调miR-503-5p的表达，靶向抑制RANK的表达，对下游的TRAP、CTSK、MMP-9等破骨标志性基因的表达产生调控，从而抑制破骨细胞的生成，促进破骨细胞凋亡[10,17-20]。ER是目前治疗骨质疏松症的重要靶点之一，ERα基因表达不足的小鼠及患者都会表现出骨质疏松的症状[21-22]。而在破骨细胞生成过程中，也有许多miRNA在不同程度地表达，并调节破骨细胞的分化和功能[23-25]。RANK属于肿瘤坏死因子超家族，分布在破骨细胞前体细胞的膜上，是介导破骨细胞生成以及破骨细胞激活和生存所必须的细胞内信号[26-28]。

本研究发现，薯蓣皂苷与雌激素均能够抑制RAW264.7细胞的破骨分化，下调RAW264.7细胞中破骨标志基因(TRAP、CTSK、MMP-9)的表达。TRAP是一种由成熟破骨细胞和融合前单核细胞表达的含铁糖蛋白，可通过水解无机磷盐类和磷酸醋酶来破坏细胞基质[29-30]；CTSK基因能反映破骨细胞的功能[31]；MMP-9可以破坏细胞外基质成分，促使破骨细胞向骨表面迁移发挥骨吸收功能[32]。而破骨相关基因的表达下调进一步证实了薯蓣皂苷对破骨分化的抑制作用。同时，薯蓣皂苷与雌激素能够明显上调ERα的蛋白及mRNA的表达水平，从而上调miR-503的miRNA表达水平，下调RANK的蛋白及mRNA表达。

综上所述，薯蓣皂苷可抑制RAW264.7细胞中破骨标志基因(TRAP、CTSK、MMP-9)的表达及破骨分化，而ERα/miR-503/RANK信号通路可能是薯蓣皂苷发挥抗骨质疏松作用的重要途径之一。后续将对该传导途径进行更深入的研究，可通过动物实验及借助相应靶向抑制剂加以验证。