单味中药及其有效成分组织蛋白酶K抑制剂研究进展

薛黎明 董志敏 金玉娥 蒋益萍 Dieter Brömme

1.上海市疾病预防控制中心，上海 200336

2.上海师范大学，上海 200234

3.中国人民解放军海军军医大学，上海 200433

4.不列颠哥伦比亚大学，温哥华V6T1Z3，加拿大

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种常见的发病率高、致残率高的骨骼疾病，给我国带来沉重的社会和经济负担。临床治疗骨质疏松药物，若长期使用多存在不良反应，如常用骨吸收抑制剂双膦酸盐可显著下调或者破坏破骨细胞，但会影响破骨细胞和成骨细胞的相互作用信号机制，导致骨形成减少[1]。组织蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)抑制剂是抗骨质疏松症新药研发的热点之一，临床前和临床研究数据表明CTSK抑制剂可特异性地抑制破骨细胞胶原降解酶的活性，而不影响破骨细胞活力，可以有效避免成骨细胞和破骨细胞双向调节的失衡[2]。

传统中药含有丰富的促进骨形成和抑制骨吸收的活性物质，如我国临床原发性骨质疏松诊疗指南中记录骨碎补总黄酮、淫羊藿苷等[3]。多种中药有效部位及中药复方，如骨碎补总黄酮、杜仲醇提取物、复方甘草附子汤、补肾通络方等[4-6]均报道具有抑制CTSK活性。目前仅有少量中药来源的CTSK抑制剂的研究，本文拟通过查询中国知网、万方和Web of Science数据库所收录的CTSK抑制剂分类、单味中药来源CTSK抑制剂的研究进展，以期为中药中开发安全、有效的CTSK抑制剂药物提供思路。

1 组织蛋白酶K概述

CTSK属于番木瓜蛋白酶家族，与组织蛋白酶B、L和S具有高度同源性，主要分布在骨组织，它特异性表达于破骨细胞边缘褶皱处，其作用底物主要是骨基质中含量达 90%以上的Ⅰ型胶原，还可降解骨基质中Ⅱ型胶原、骨桥接素和骨连接素等蛋白，是破骨细胞中溶骨活性最强的关键酶[7]。CTSK基因表达的变异或缺失会导致患者患致密性成骨不全症、骨质疏松症和骨脆性骨折增加等疾病[8]。除了骨组织，CTSK在皮肤、心脏、骨骼肌、胎盘、小肠、肺、大脑和甲状腺等组织中均有表达，发挥着重要的生理作用。CTSK基因缺失可引起肺纤维化、呼吸、心血管、免疫系统功能障碍、甲状腺功能异常、癌症、甚至学习记忆缺陷等症[9]。

2 组织蛋白酶K抑制剂

2.1 活性位点抑制剂

基于CTSK与抑制剂共培养复合物的晶体结构解析，发现CTSK分子活性位点位于顶部的一个V形裂缝，结构域由Cys25、His162和Asn161等氨基酸残基组成(见图1)[10]，它含有催化二氢半胱氨酸-组氨酸结构，可以接受脯氨酸残基，这与胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸残基的高含量有关[11]。CTSK在酸性环境中，通过自动断开其前端部分而暴露其催化活性位点，直接作用于胶原端肽区，将完整的三股螺旋体结构胶原蛋白降解成不规则结构的纤维碎片[11]。目前制药企业研发CTSK抑制剂均是针对活性位点开发的，通过直接竞争性与CTSK活性位点结合，抑制CTSK活性，称为活性位点抑制剂(active site inhibitor)。迄今为止，有50多种CTSK抑制剂药物申请了专利，但都在临床前或临床试验阶段宣告失败，其失败原因与导致非骨骼组织严重不良反应密切相关[2]。

2.2 非活性位点抑制剂

CTSK与粘多糖(glycosaminoglycans，GAGs)，如硫酸软骨素(CSA)，结合后可形成一种CTSK-GAGs复合物，只有这种复合物形成，CTSK才能够发挥胶原酶活性，如果GAGs缺失，CTSK将失去胶原酶活性，但仍保留CTSK的其他正常肽酶活性[10]。非活性位点抑制剂(Ectosteric-site inhibitor)不是竞争性抑制三螺旋胶原与CTSK的结合，而是竞争性抑制CTSK与GAGs结合的寡聚化位点，GAG-CTSK结合位点G1含K119、K122、R123和R127残基，结合位点G2含K40、K41、R108、R111和K214残基[12](图1)。Sharma等[13]在人CTSK(1ATK)蛋白分子上鉴定了非活性位点1的结构域由一个由Y87、E93和E94的钩状环形成(图1)[13]。Novinec等[14]报道在CTSK(1ATK)分子上鉴定到非活性位点2，其位置毗邻与于GAGs位点，结构域内含有K119、N199、R198、K176、Y169、R123和K122残基(图1)，除该位点外，还预测了CTSK分子可能还存在6个潜在的CTSK变构作用位点[14]。目前基于非活性位点抑制剂的研究，都来自传统中药的活性物质。

图1 组织蛋白酶K变构位点位置和结构域。黄色：活性位点[10]；绿色：非活性位点1[13]；粉红色：GAG位点[12]；青色：非活性位点2[14]Fig.1 Location and binding pocket of allosteric sites on cathepsin K. Yellow： active site [10], Green： Ectosteric site 1[13], Pink： GAG site[12], and Cyan： Ectosteric site 2[14]

3 单味中药及其有效成分CTSK抑制剂研究

3.1 丹参

丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，临床主要用于预防和治疗心脑血管疾病。Guo等[15]综述了传统中药丹参治疗骨质疏松的临床应用，超过30%的中药方剂包含丹参。发现丹参乙醇提取物显著抑制胶原降解，而不影响CTSK降解活性位点合成底物Z-FR-MCA，故推测丹参乙醇提取物可能含有CTSK非活性位点抑制剂。Preety等[16]研究丹参中30多种丹参酮类成分进行胶原酶活性，结果发现6种丹参酮化合物抗胶原酶IC50值均小于500 nmol/L，能显著抑制破骨细胞骨吸收活性，但对破骨细胞活力和骨形成活性无影响，被认为是较为理想的非活性位点抑制剂[17]。其中二氢丹参酮I(DHT1)和丹参酮ⅡA磺酸钠的抗胶原酶活性IC50为(6.2±0.7)μmol/L和(2.7±0.2)μmol/L，接近默克odanacatib的(0.21±0.05)μmol/L，对CTSK活性位点底物明胶、甲状腺球蛋白和转化生长因子(TGF-β)没有抑制作用[13,18]。分子对接结果发现DHT1结合在CTSK非活性位点1中Tyr87、Pro88和Val90氨基酸残基形成的沟状结构，与Asn99残基氢键相互作用[13]。丹参酮ⅡA磺酸钠也同样与活性位点1结构裂缝相吻合，与Glu94和Ser95形成氢键相互作用，与Tyr87、Pro88和Met97的疏水残基相互作用，其对接得分最高，原因可能是由于含有一个磺酸根基团且带有电荷使其结合更紧密[18]。最新临床研究发现丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可有效治疗骨质疏松和术后骨折[19-20]。

3.2 淫羊藿

淫羊藿，又名仙灵脾，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，为中医补肾壮骨的代表药材，其活性部位淫羊藿总黄酮和成分淫羊藿苷临床证实对治疗骨质疏松效果显著[3,21]。戴娜桑等[22]研究发现10 μmol/L淫羊藿苷就可以显著抑制CTSK降解胶原活性，1 mmol/L淫羊藿苷对CTSK活性位点荧光底物A-H-D-ALK-AMC具有明显的抑制作用，抑制率高达75.34%。Sun等[23]采用SDS-PAGE方法考察淫羊藿苷降解胶原作用，结果发现淫羊藿苷在5 μmol/L浓度时，显著抑制胶原降解，其呈剂量依赖性，推测是一种有效的CTSK抑制剂。但Xue等[24]研究报道浓度高达100 μmol/L的淫羊藿苷对CTSK降解胶原和合成底物Z-FR-MCA无任何抑制作用。

3.3 墨旱莲

墨旱莲，具有滋补肝肾，凉血止血功效，适用于肝肾阴虚，牙齿松动等症，与女贞子组方二至丸临床用于治疗骨质疏松。墨旱莲乙醇提取物(EAE)和活性成分蟛蜞菊内脂报道能抑制破骨细胞分化和下调骨吸收标记基因c-src和CTSK表达[25-26]。蒋益萍等[27]研究了墨旱莲正丁醇、乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷提取物对CTSK降解胶原和合成底物Z-FR-MCA活性的影响，结果发现墨旱莲石油醚和正丁醇部位的胶原降解抑制率分别为95.6%和78.3%，而与Z-FR-MCA结合的抑制率分别为72.3%和25.9%，说明墨旱莲正丁醇部位可能存在潜在非活性位点抑制剂。正丁醇部位化学成分墨旱莲皂苷V、I、Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和刺囊酸6个成分对Z-FR-MCA底物结合活性均无抑制作用，仅墨旱莲皂苷Ⅸ在100 μmol/L显著抑制CTSK胶原酶活性，抑制率为70.3%，推测墨旱莲皂苷Ⅸ可能为潜在的非活性位点抑制剂。

3.4 补骨脂

补骨脂，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻之功效，药理活性表现为抗肿瘤、抗菌、抗骨质疏松、雌激素作用等。丁黎艳等[28]对补骨脂33种化学成分与人CTSK蛋白分子(3KWZ)的活性位点结构域进行分子对接，发现有8个与CTSK具有较高亲和力，均存在两个疏水基团与CTSK活性位点的疏水空穴结合。其中6个是黄酮类化合物，推测原因为黄酮6C-3C-6C的基本骨架，3C烯酮结构，空间位阻小，易于CTSK活性位点凹槽位置较好吻合，烯酮中的羰基氧或6C骨架上的羟基易于Cyr25残基形成氢键。因此，补骨脂可能含有多个CTSK抑制剂，通过多成分协同抑制骨吸收作用。但是，近年来补骨脂及抗骨质疏松活性成分补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚等均报可能引起肝损伤，临床使用需予以注意[29]。

3.5 其他

王丹华[30]分别构建了人CTSK(4x6i)蛋白分子活性位点结构和CTSK变种(5j94)[14]的别构位点药效团模型，对由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参和地黄组成的中成药仙灵骨葆胶囊中活性化合物进行分子对接，分别得到98个和75个化合物对接成功，且分别展示了活性位点和别构位点综合评分最佳的9个化合物，多以苯丙素、黄酮、环烯醚萜苷和三萜结构骨架类型化合物为主。仙灵骨葆胶囊是临床常用于治疗骨质疏松中成药，推测可能是存在多种CTSK抑制剂协同发挥作用。

4 展望

临床治疗骨质疏松中药是理想的CTSK抑制剂候选库，具疗效确切且不良反应小的优点。中药中可能不仅含有CTSK抑制剂降低骨吸收，同时也存在促进骨形成活性成分，二者组合协同发挥疗效。甚至筛查到的CTSK抑制剂，除了抑制骨吸收，还可能促进骨形成活性，表现出多靶点调控骨代谢，如淫羊藿苷双向调节骨形成和骨吸收作用，多靶点调控作用也可能降低其作为CTSK活性位点抑制剂的不良反应。这种中药的整体观组合治疗或多靶点作用的思路，可能是中药临床发挥抗骨质疏松的重要作用机理。

CTSK非活性位点抑制剂不仅发挥CTSK降解骨胶原的活性，且不会影响其在其他组织的正常生理活性，是潜在的理想型CTSK抑制剂药物研发的新方向。从中药中筛选CTSK非活性位点抑制剂，不存在临床试验发现的活性位点抑制剂的安全性问题。